베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

이 절차의 전반적인 목표는 일차 지방세포를 분리하고 배양에서 베이지색 또는 밝은 세포로의 분화를 유도하는 것입니다. 첫 번째 단계는 생쥐의 지방 조직을 해부하는 것입니다. 다음으로, 조직은 콜라겐 분해 효소로 소화됩니다.

기질 혈관 분획이 분리되면 세포가 플레이트됩니다. 마지막 단계는 세포가 베이지색 또는 밝은 세포로 분화되도록 유도하는 것입니다. 궁극적으로, 갈색 지방 세포 특이적 유전자의 발현이 증가했음을 보여주기 위해 분석 방법이 사용됩니다.

이 방법은 갈색 지방 조직의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 분자 메커니즘이 밝은 세포 또는 be 세포의 발달을 조절하는 것입니다. 이 기술의 의미는 비만 및 기타 생활 습관병 치료로 확장됩니다. 인간의 갈색 지방 조직의 조작은 잠재적인 치료 개입으로 사용될 수 있기 때문에 첫 번째 단계는 소화 매체를 준비하는 것입니다.

그런 다음 안락사 후 지방 조직을 제거합니다. 먼저, 견갑골 간 갈색 지방 조직이나 박쥐의 등을 따라 목까지 잘라 분리합니다. 갈색 지방 조직의 두 엽은 어깨 사이의 피부 바로 아래에서 찾을 수 있습니다.

다음으로, 박쥐를 덮고 있는 얇은 백색 지방층을 조심스럽게 제거합니다. 일단 분리되면 조직을 깨끗한 PBS에 직접 놓습니다. 서혜부 백색 지방 조직 또는 와트는 양쪽 피부 바로 아래에 있습니다.

그것은 허벅지 안쪽으로 뻗어 고환을 향해 아래로 뻗어 있습니다. 티슈를 제거하고 깨끗한 PBS에 넣습니다. 다음 단계는 박쥐 샘플과 젖은 샘플 모두에 적용됩니다.

조직 섹션에서 머리카락, 골격근 및 결합 조직과 같은 모든 오염 물질을 신속하게 제거합니다. 다음으로, PBS로 박리 매체가 희석되는 것을 방지하기 위해 종이 타월로 조직을 빠르게 건조시키고 마른 판에 놓습니다. 소화 매체를 추가하고 조직을 작은 조각으로 다집니다.

다음으로, 조직을 나머지 소화 매체가 들어 있는 50ml 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 40-50분 동안 계속 교반하여 소화시킵니다. 10-15분마다 확인하여 소화가 잘 되고 있는지 확인하고 과도한 소화를 방지하십시오.

조직이 잘 소화되면 소화를 멈춥니다. 5ml의 완전한 배지를 첨가하고 잘 혼합하면 세포가 거의 완전히 균질화되어야 합니다. 다음으로, 샘플을 700배 G에서 10분 동안 원심분리합니다.

기질 혈관 분획은 이제 튜브 바닥의 갈색 펠릿으로 볼 수 있어야 하며, 위쪽의 기름지고 성숙한 지방 세포층과 대부분의 액체 층을 흡인해야 합니다. 다음으로 펠릿을 10밀리리터에 녹이고 매체를 완성하고 잘 섞습니다. 혼합이 완료되면 새 50ml 튜브 위에 셀 스트레이너를 놓고 세포 현탁액을 여과합니다.

여과된 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮기고 700배 G로 10분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 배지를 흡입하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 10ml의 완전한 중간 피펫에 넣고 필요에 따라 세포를 잘 혼합합니다.

일반적으로 5마리의 쥐는 10cm 접시의 서혜부 와트 접시 2개와 박쥐 접시 1개를 산출합니다. 도금 후 1-2시간. PBS로 미디엄 워시를 두 번 흡입하고 새 미디엄을 추가합니다.

이 단계는 적혈구, 면역 세포 및 기타 오염 물질을 제거할 수 있으므로 중요합니다. 유지 보수 및 유도 매체는 미리 준비됩니다. 1차 지방세포가 95-97%confluence로 성장하면 유도 배지로 규칙적인 완전한 배지를 변경합니다.

48시간 후 배지를 0.5마이크로몰 RO 글리타존을 함유한 유지 배지로 변경합니다. 추가 48시간 후, 추가로 2-3일 동안 1마이크로몰 RO 글리타존을 포함하는 새로운 유지 관리 매체로 변경합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 유도 배지를 처음 첨가한 후 6-7일 후에 유도 후 약 3-4일 후에 방울이 나타납니다.

세포는 성숙한 지방 세포로 완전히 분화되어야 하며 기름 방울로 채워져야 합니다. 이제 세포를 수확하여 추가 분석에 사용할 수 있습니다. 일차 지방세포의 갈변은 여기에서 볼 수 있듯이 Q-R-T-P-C-R에 의해 갈색 지방 특이적 또는 선택적 유전자의 mRNA를 측정하여 평가할 수 있습니다.

RO glitazone, 강력하게 유도 된 UCP one mRNA 발현 FORSKOLIN 치료는 여기에서 cyclic A MP로 지정되었습니다. RO 글리타존이 UCP 1 발현을 유도하여 더욱 증강되었습니다. 씨디아. 또 다른 갈색 지방 선택적 유전자도 용량 의존적 방식으로 강력하게 증가했다. RO 글리타존 치료는 또한 갈색 지방과 백색 지방 모두에 대한 FABP 4 및 지방 생성 마커의 발현을 증가시켰습니다.

이 갈변 효과는 단순히 지방 형성 자체의 향상 때문이 아닙니다. UCP 1 및 CDIA 발현의 유도는 여전히 유의했기 때문에 mRNA 수치가 FABP 4로 정규화되더라도 이 웨스턴 블롯은 UCP 1의 단백질 수치 증가를 확인시켜줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 배양에서 지방세포를 분리하는 방법과 이러한 세포를 베이지색 또는 밝은 세포로 분화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.