La longueur des télomères et de la télomérase activité; Une Yin et Yang de la sénescence cellulaire

L’objectif global de cette procédure est de fournir une méthode courte, précise et peu coûteuse pour évaluer la longueur des télomères et l’activité des télomères dans plusieurs tissus et espèces. Ceci est accompli en isolant d’abord l’ADN génomique pour la détermination de la longueur des télomères à l’aide de la PCR quantitative en temps réel. La deuxième étape consiste à isoler et à lyrer des cellules d’un même tissu dans un tampon qui préserve la fonction de la télomérase et à mesurer quantitativement la télomérase à l’aide de la PCR en temps réel.

En fin de compte, la détermination de la longueur des télomères et la détection de l’activité de la télomérase sont utilisées pour trouver les relations entre la longueur des télomères et la sénescence cellulaire, les mécanismes possibles du raccourcissement des télomères et les réponses de récupération au vieillissement et aux états de prolifération cellulaire. J’ai découvert cette méthode pour la première fois lorsque je cherchais un moyen rapide et facile de mesurer les longueurs et l’activité de l’omera. L’implication de cette technique s’étend au diagnostic des maladies associées à l’âge et de la mort prématurée car elle rend compte de l’état des cellules, ce qui reflète l’état des organes et la forme globale du corps.

La démonstration de cette procédure sera faite par M. Ur Bogo, un technicien de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, isolez l’ADN du sang du sujet à l’aide du kit Qiagen DNE, spécialement formulé pour les sources de sang à l’étape finale. Éluer l’ADN dans de l’eau de qualité PCR et mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre.

Ensuite, préparez des amorces PCR mères telles que décrites par OC Callahan et al pour le gène à copie unique ou le contrôle SCG et pour les télomères en les diluant à 100 picomoles par microlitre. En utilisant de l’eau de qualité PCR pendant que les amorces se réhydratent, préparez des dilutions en série de l’ADN isolé. Commencez par diluer l’ADN de base avec de l’eau de qualité PCR jusqu’à une concentration maximale de 6,1 nanogrammes par microlitre pour les réactions de télomères et de 1,8 nanogramme par microlitre.

Pour les réactions SCG, laissez la dilution reposer pendant au moins 15 minutes avant de passer à la suivante. Après 15 minutes, préparez la dilution suivante selon le tableau indiqué ici. Répétez cette opération pour chaque dilution indiquée.

Ensuite, configurez les réactions PCR dans une plaque PCR standard. Chaque échantillon, ainsi que les commandes SCG, sont exécutés en trois exemplaires. Tout d’abord, ajoutez six microlitres d’eau de qualité PCR dans chaque puits, puis ajoutez 10 microlitres du mélange de réaction cyber green.

Ajoutez ensuite les amorces dans les quantités indiquées ici dans leurs puits respectifs. Ensuite, diluez davantage une aliquote de chacune des amorces de base avec de l’eau de qualité PCR dix fois afin que la concentration finale soit de 10 picomoles par microlitre. Enfin, ajoutez deux microlitres d’ADN dilué en série dans leurs puits respectifs et recouvrez la plaque d’une feuille de plastique adhésive pour sceller le contenu.

Placez ensuite la plaque dans la machine PCR en temps réel. Ensuite, préparez un programme sur le cycleur léger Roche four 80, en commençant par une dénaturation de 10 minutes. Faites un pas à 95 degrés Celsius, puis faites un cycle de 95 degrés Celsius pendant 10 secondes, 60 degrés Celsius pendant cinq secondes et 72 degrés Celsius pendant 11 secondes.

Pour un total de 50 cycles, effectuez des mesures cyber vertes après chaque cycle. Ensuite, commencez le programme une fois le thermocycleur terminé. Réglez la ligne CT au début de la courbe exponentielle et enregistrez les valeurs de cycle à partir du moment où chaque échantillon franchit la ligne de seuil.

Ensuite, calculez le rapport des numéros de cycle entre les échantillons de télomères et de gènes à copie unique. Étant donné que le télomère a plusieurs régions, qui s’amplifieront à chaque cycle, les valeurs CT des télomères seront plus petites que le nombre de copies d’un seul gène, ce qui entraînera un rapport inférieur à un. Enfin, calculez la longueur des télomères en vous basant sur les travaux de Terry Etal, où un télomère par unité de rapport de copie d’un seul gène équivaut à une longueur moyenne de télomères de 4 270.

paires de bases dans les leucocytes effectuent des mesures de l’activité de la télomérase à l’aide de la détection quantitative de la télomérase d’Allied Biotech pour commencer les mesures, collecter 10 à la cinquième à 10 à la sixième cellules sanguines périphériques et les rincer dans du PBS. Ensuite, granulez-les à 500 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, mettez la pastille en suspension dans 200 microlitres d’un tampon de lyse du kit de dosage et incubez sur de la glace pendant 30 minutes.

Après l’incubation, centrifuger les échantillons à 12 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Pour granuler les débris de la cellule, transférez 160 microlitres du surnageant résultant dans un tube frais et congelez le surnageant restant dans un bain d’éthanol et de glace sèche avant de le stocker à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation répétée. Ensuite, déterminez la concentration en protéines du surnageant à l’aide d’un dosage standard des BCA.

Pour chaque échantillon prélevé, calculez la quantité de protéines nécessaire pour le test en fonction de la plage de fonctionnement du kit de télomérase. Ensuite, comme la télomérase est une enzyme sensible à la chaleur, la chaleur inactive la moitié de chaque échantillon pour l’utiliser comme contrôle négatif par incubation à 85 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, préparez la courbe standard quantitative en diluant le stock en série.

Les oligonucléotides TSR diluent la solution mère cinq fois à une dilution de une à cinq à l’aide d’un tampon de lyse. Les oligonucléotides TSR ont une séquence identique à celle des amorces de télomères et sont d’une concentration connue. Ensuite, mettez en place le mélange maître composé de 12,5 microlitres de deux prémélanges quantitatifs de détection de télomérase et de 11,5 microlitres d’eau de qualité PCR par échantillon et mélange.

Ensuite, pipetez 24 microlitres du mélange principal dans chaque tube utilisé. Une fois que le mélange maître a été distribué, ajoutez un microlitre de chaque modèle composé soit de l’échantillon standard, soit d’un échantillon chaud et activé, soit d’un échantillon régulier dans les puits. Ensuite, scellez la plaque avec une feuille de plastique adhésive et mélangez les échantillons par vortex.

Ensuite, placez-les dans le système de détection PCR en temps réel. Configurez le programme PCR pour qu’il commence à 25 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pendant ce temps, la réaction de télomérase aura lieu.

Poursuivez avec 95 degrés Celsius pendant 10 minutes pour l’étape d’activation initiale de la PCR. Effectuez ensuite 40 cycles de 95 degrés Celsius pendant 30 secondes, 60 degrés Celsius pendant 30 secondes et 72 degrés Celsius pendant 30 secondes. Pour amplifier les modèles de télomères ajoutés pendant les 20 minutes à 25 degrés Celsius.

Enfin, exécutez le programme et collectez les valeurs de cycle de seuil pour chaque échantillon. Générez ensuite une courbe standard à l’aide des valeurs CT et utilisez-la pour calculer l’activité de la télomérase. Dans les échantillons présentés.

Voici les résultats de la PCR en temps réel d’un sujet de 65 ans. Le gène des télomères représenté par les lignes rouge vif atteint sa courbe exponentielle après environ 27 cycles. Le deuxième ensemble de lignes représente l’amplification du gène à copie unique, qui n’a qu’une seule copie dans le génome, et a donc moins de copies que les échantillons de télomères représentés par les lignes rouges.

De plus, le gène à copie unique atteint sa courbe exponentielle après environ 31 cycles. Les lignes brunes représentent la courbe standard 33 basée sur une dilution en série des concentrations d’échantillon connues. La courbe standard pour le logarithme de la concentration en fonction des valeurs seuils est illustrée ici.

Une ligne droite confirme que la dilution en série a été mesurée et chargée avec précision. Les résultats de l’analyse PCR en temps réel sont ensuite utilisés pour estimer la longueur des télomères. Une unité de rapport de copie de télomère par rapport à un seul gène équivaut à une longueur moyenne de télomère de 4 270 paires de bases dans les leucocytes et à partir de ces données, il en résulte un rapport de 0,87, ce qui correspond à une moyenne de 3 715 paires de bases et une longueur intermédiaire pour une personne de cet âge.

À l’aide des résultats des tests quantitatifs de PCR en temps réel, une relation entre l’activité des télomères et le rapport entre les télomères et les copies d’un seul gène peut être élucidée. Ce graphique montre une forte relation entre les deux tests après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine du vieillissement d’explorer la sénescence cellulaire dans l’organisme modal, la démographie des patients et les systèmes organiques.