Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l'induction de petites molécules

L’objectif général de l’expérience suivante est de dériver une descendance cardiaque directement et exclusivement à partir de cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes en utilisant l’induction de petites molécules. Ceci est réalisé en ajoutant du nicotinamide à des cellules ES humaines indifférenciées maintenues dans des conditions définies. Ensuite, les cellules de différenciation cardiaque sont détachées pour former des blastes cardio, des amas cellulaires flottants dans une culture en suspension.

Une fois formés, les blastes cardiaques sont attachés aux milieux de différenciation cardiaque où ils continuent à se développer en cardiomyocytes battants. En fin de compte, les résultats sont évalués par immunofluorescence avec déconvolution ou microscopie confocale et par des enregistrements électrophysiologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’induire efficacement des cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes exclusivement vers une lignée cardiaque par simple apport de petites molécules.

Alors que dans les méthodes existantes de différenciation multi-lignées, seule une petite fraction des cellules poursuit un phénotype cardiaque. Il y a quelques étapes à suivre lors de la préparation des solutions mères. Prenez soin de ralentir la décongélation du matrigel et de la laminine humaine de moins 80 degrés Celsius à quatre degrés Celsius, de stocker le support pendant la nuit, de le conserver à quatre degrés Celsius et de toujours le réchauffer à 37 degrés Celsius avant de l’utiliser.

De plus, lors de la préparation de milieux cellulaires humains, certains des suppléments sont ajoutés juste avant qu’ils ne soient utilisés. Il s’agit notamment de BFGF, d’acide ascorbique, d’insuline humaine active dans A et de transfert dans. Ensuite, préparez les solutions de travail matrigel ou laminine humaine immédiatement avant le revêtement de la plaque.

Incuber les plaques à 37 degrés SIU dans 5 % de dioxyde de carbone Après la préparation des plaques de culture tissulaire pré-enrobées de gélatine. La gélatine peut être remplacée par la solution de travail de gel de matra ou de laminine. Enduisez ces assiettes en les laissant incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Commencez par laisser les colonies de cellules ES humaines se développer pendant cinq à sept jours, puis préparez-vous à en diviser certaines : sélectionnez des colonies avec plus de 75 % de cellules ES humaines indifférenciées. Ils sont généralement légèrement opaques avec des bords définis, des colonies contenant des ventes incitatives empilées. Une indication du début de la différenciation semble généralement être des colonies blanches contenant principalement des cellules différenciées semblent généralement être claires.

Ne choisissez pas de colonies blanches ou claires. Tenez les plaques à la lumière et utilisez un marqueur pour délimiter les colonies légèrement opaques au bas des plaques le long des contours. Utilisez le bord d’une pointe de pipette P double stérile pour détacher la couche de fibroblastes environnante de la colonie de cellules ES humaines.

Ensuite, retirez les cellules fibroblastiques environnantes et retirez également toutes les parties différenciées de la colonie. Maintenant, aspirez l’ancien milieu contenant les cellules différenciées détachées. Ensuite, dans chaque puits, lavez une fois les cellules indifférenciées avec des milieux cellulaires ES humains dépourvus de BFGF, puis ajoutez trois millilitres de milieux cellulaires ES humains frais contenant B-F-G-F-B-F-G-F est ajouté au milieu frais immédiatement avant utilisation.

Utilisez maintenant une pointe de pipette P double stérile pour couper les colonies en petits morceaux et les détacher de la plaque. Tirez les morceaux de colonie détachés dans leur milieu dans un tube conique de 50 millilitres. Tirez un média supplémentaire d’un millilitre de rinçage par puits.

Les cellules sont maintenant prêtes pour une différenciation plus poussée à l’aide de petites molécules. Commencez par réchauffer les assiettes fraîchement enrobées à 37 degrés Celsius. Aspirez la solution d’enrobage des plaques et ajoutez une aliquote de quatre millilitres de milieu contenant des morceaux de colonie dans chaque puits, puis transférez doucement les plaques dans un incubateur sans les secouer.

Ne dérangez pas les plaques pour qu’elles puissent semer. Retirez ensuite la plupart des anciens supports, en laissant juste assez de support pour que les cellules restent immergées. Il ne faut jamais laisser les cellules se dessécher.

Mélangez des milieux ESL humains frais contenant du FGF et du nicotinamide de base et des millilitres de formule de ce milieu dans chaque puits. Le milieu peut être stocké jusqu’à deux semaines à quatre degrés Celsius, au cours desquelles il peut être utilisé pour rafraîchir la culture cellulaire tous les deux jours afin de faire croître les colonies. Au bout de huit à 10 jours, les cellules auront subi des changements morphologiques jusqu’à devenir de grandes cellules différenciées multipliées et empilées.

Procédez ensuite à une culture en suspension pour faire une culture en suspension en commençant par détacher les colonies ESL des cellules qui se sont spontanément différenciées et ont migré pour former une couche de fibroblastes. Utilisez la technique susmentionnée avec une pointe de pipette stérile, puis aspirez l’ancien support contenant des cellules fibroblastiques détachées flottantes. Lavez les cellules une fois avec un milieu HESC et mettez-les en suspension dans trois millilitres de milieu HESC, maintenant à l’aide d’une pointe stérile à deux pipettes P.

Coupez les colonies en petits morceaux et détachez-les de l’assiette. Tirez le milieu avec les colonies détachées dans un seul tube conique de 50 millilitres. Rincez les puits avec un millilitre de média et ajoutez le rinçage à la piscine.

Ensuite, aliquote quatre millilitres des cellules regroupées dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse à six puits pendant quatre à cinq jours. Gardez la plaque dans un incubateur pour permettre aux amas cellulaires flottants ou aux explosions cardio de se former pour faire avancer les explosions cardio vers le phénotype cardiomyocytaire battant. Rassemblez-les dans un tube conique de 50 millilitres avec leur support.

Ensuite, centrifugez les cellules à 1 400 tr/min pendant cinq minutes. Aspirez, pesez autant de vieux milieux que possible et ajoutez une quantité égale de différenciation cardiaque fraîche. Milieu contenant 10 millimolaires de nicotinamide.

Mélangez les cardioblasts flottants avec du pipetage, puis aliquotez quatre millilitres de suspension des cardioblastes dans chaque puits de six plaques de culture tissulaire. Transférez les plaques dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pour permettre aux explosions cardio de se fixer aux plaques de culture tissulaire pendant la nuit. Un jour sur deux dans la culture.

Remplacez le milieu de différenciation cardiaque contenant 10 mini molin de nicotinamide le huitième jour. Passez à la différenciation cardiaque. Les milieux sans nicotinamide continuent de remplacer les milieux tous les deux jours.

Dans les deux semaines suivant le retrait du nicotinamide, les cardiomyocytes commenceront à apparaître et l’augmentation du nombre de nicotinamide sera rendue suffisante pour induire les cellules ES humaines maintenues dans le système de culture défini à passer de la pluripotence exclusivement à un phénotype cardio-mésodermique. Lors de l’exposition de cellules ES humaines indifférenciées au nicotinamide, toutes les cellules de la colonie ont subi des changements morphologiques en grandes cellules différenciées qui ont régulé à la baisse l’expression de l’OCT quatre. Les cellules ont également commencé à exprimer le facteur de transcription spécifique cardiaque, NK X 2,5, et à exprimer également l’alpha actinine.

Les deux caractéristiques sont cohérentes avec le phénotype du mésoderme cardio. Ces cellules différenciées continuent de se multiplier et d’augmenter en taille dans les zones des colonies où les cellules s’étaient empilées. L’expression de NKX 2.5 est devenue plus intense Après le détachement, les cellules ES humaines traitées au nicotinamide ont formé des explosions cardiaques dans une culture en suspension.

Après avoir permis aux blastes cardio de se fixer, les blastes cardio ont été traités avec du nicotinamide pendant une semaine, une à deux semaines après le sevrage du nicotinamide, les cardiomyocytes ont commencé à apparaître avec une augmentation drastique de l’efficacité. Ils sont apparus comme des amas cellulaires qui pulsaient avec des contractions rythmiques, la différenciation spontanée multi-lignées des cellules qui n’ont pas subi de traitement IDE n’a pas exprimé ces caractéristiques. Les cellules des groupes de cardiomyocytes ont exprimé des marqueurs caractéristiques des cardiomyocytes, notamment NK X 2,5 et l’alpha actinine.

Les contractions des cardiomyocytes battants ont été confirmées par des profils électriques comme étant fortes, rythmiques tout en étant coordonnées et bien entraînées, elles présentaient des impulsions régulières rappelant les complexes P-Q-R-S-T, vus à partir d’électrodes de surface corporelle dans les électrocardiogrammes cliniques. De plus, les cardiomyocytes pourraient conserver leur forte contractilité pendant plus de trois mois une fois maîtrisés. Cette technique peut être utilisée pour générer des précurseurs cardiaques et battre uniformément des cardiomyocytes à partir de cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes en cinq semaines environ si elle est effectuée correctement.