Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l'induction de petites molécules

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir des cellules cardiaques directement et exclusivement à partir de cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes, en utilisant une induction par de petites molécules. Ceci est réalisé en ajoutant de la nicotinamide à des cellules ES humaines non différenciées maintenues dans des conditions définies. Ensuite, les cellules en cours de différenciation cardiaque sont détachées pour former des cardioblastes, des agrégats cellulaires en suspension flottants.

Une fois formés, les cardio-blastes sont mis en culture dans un milieu de différenciation cardiaque où ils continuent de se développer en cardiomyocytes battants. En fin de compte, les résultats sont évalués par immunofluorescence associée à une microscopie de déconvolution ou confocale, ainsi que par des enregistrements électrophysiologiques. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une induction efficace de cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes exclusivement vers une lignée cardiaque grâce à l'ajout simple de petites molécules.

Alors que, dans les méthodes existantes de différenciation multilignée, seule une petite fraction des cellules adopte un phénotype cardiaque. Quelques étapes requièrent une attention particulière lors de la préparation des solutions mères. Veillez à décongeler lentement la matrigel et la laminine humaine en passant de moins 80 degrés Celsius à quatre degrés Celsius pendant la nuit, conservez les milieux à quatre degrés Celsius et réchauffez toujours les milieux à 37 degrés Celsius avant utilisation.

En outre, lors de la préparation du milieu pour cellules souches embryonnaires humaines, certains suppléments sont ajoutés juste avant utilisation. Ces suppléments comprennent le BFGF, l'acide ascorbique, l'insuline humaine active en A et le transfert en. Ensuite, préparez les solutions travail de matrigel ou de laminine humaine immédiatement avant le revêtement des plaques.

Incuber les plaques à 37 degrés SIU dans un atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone après avoir préparé les plaques de culture tissulaire pré-enrobées de gélatine. La gélatine peut être remplacée par une solution travail de matrigel ou de laminine. Enrober ces plaques en les incubant toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Commencez par laisser les colonies de cellules souches embryonnaires humaines se développer pendant cinq à sept jours, puis préparez-vous à en diviser certaines. Sélectionnez les colonies contenant plus de 75 % de cellules souches embryonnaires humaines non différenciées. Elles sont généralement légèrement opaques, avec des bords bien définis et des cellules empilées. Un signe de début de différenciation apparaît généralement sous forme de colonies blanches ; les colonies composées majoritairement de cellules différenciées apparaissent généralement transparentes.

Ne sélectionnez pas les colonies blanches ou transparentes. Tenez les boîtes de Pétri à la lumière et utilisez un marqueur pour tracer le contour des colonies légèrement opaques sur le fond des boîtes, en suivant leurs limites. Utilisez le bord d'une pipette stérile de type P2 pour détacher la couche de fibroblastes environnante de la colonie de cellules souches embryonnaires humaines.

Ensuite, retirez les cellules fibroblastes environnantes ainsi que toutes les parties différenciées de la colonie. Aspirez maintenant l'ancien milieu contenant les cellules différenciées détachées. Lavez ensuite une fois les cellules indifférenciées dans chaque puits avec un milieu pour cellules souches embryonnaires humaines dépourvu de BFGF, puis ajoutez trois millilitres de milieu frais pour cellules souches embryonnaires humaines contenant du B-F-G-F—le B-F-G-F est ajouté au milieu frais immédiatement avant utilisation.

Utilisez maintenant une pipette stérile de type P2 pour découper les colonies en petits morceaux et les détacher de la boîte. Aspirez les morceaux de colonies détachés avec leur milieu dans un tube conique de 50 millilitres. Aspirez un rinçage supplémentaire de un millilitre de milieu par puits.

Les cellules sont désormais prêtes pour une différenciation ultérieure à l'aide de petites molécules. Commencez par réchauffer les plaques fraîchement revêtues à 37 degrés Celsius. Aspirez la solution de revêtement des plaques et ajoutez un aliquot de quatre millilitres de milieu contenant des fragments de colonies dans chaque puits, puis transférez délicatement les plaques dans un incubateur sans les agiter.

Ne pas perturber les plaques afin de permettre l'adhérence des cellules. Ensuite, retirer la majeure partie de l'ancien milieu, en laissant juste assez de milieu pour que les cellules restent immergées. Les cellules ne doivent jamais être laissées à l'air sec.

Mélangez du milieu ESL humain frais contenant du FGF basique et de la nicotinamide, et ajoutez le volume indiqué en millilitres de ce milieu dans chaque puits. Le milieu peut être conservé jusqu'à deux semaines à quatre degrés Celsius, durant lesquelles il peut être utilisé pour renouveler la culture cellulaire tous les deux jours afin de faire croître les colonies. Après huit à dix jours, les cellules auront subi des changements morphologiques, devenant de grandes cellules différenciées qui se sont multipliées et accumulées.

Ensuite, procédez à une culture en suspension : pour initier une culture en suspension, commencez par détacher les colonies ESL des cellules qui se sont différenciées spontanément et ont migré pour former une couche de fibroblastes. Utilisez la technique mentionnée ci-dessus avec une pointe de pipette stérile, puis aspirez le milieu ancien contenant les cellules de fibroblastes détachées en suspension. Lavez les cellules une fois avec du milieu HESC et resuspendez-les dans trois millilitres de milieu HESC, en utilisant désormais une pointe de pipette stérile P2.

Couper les colonies en petits morceaux et les détacher de la plaque. Aspirer le milieu contenant les colonies détachées dans un seul tube conique de 50 millilitres. Rincer les puits avec un millilitre de milieu et ajouter le rinçage au mélange.

Ensuite, aliquoter quatre millilitres des cellules regroupées dans chaque puits d'une plaque à six puits à attachement ultra-faible pendant quatre à cinq jours. Maintenir la plaque dans un incubateur afin de permettre la formation de grappes cellulaires flottantes ou de cardios-blastes, puis faire évoluer les cardios-blastes vers le phénotype de cardiomyocytes battants. Rassembler le tout dans un tube conique de 50 millilitres avec leur milieu.

Ensuite, centrifuger les cellules à 1 400 tr/min pendant cinq minutes. Aspirer, peser autant que possible l'ancien milieu et ajouter une quantité équivalente de nouveau milieu de différenciation cardiaque contenant 10 millimolaire de nicotinamide.

Mélangez délicatement les cardio-blastes en suspension à l’aide d’une pipette, puis répartissez quatre millilitres de la suspension de cardio-blastes dans chaque puits de plaques de culture tissulaire à six puits. Placez les plaques dans un incubateur humidifié à 37 °C afin de permettre aux cardio-blastes de s’attacher aux plaques de culture tissulaire pendant toute la nuit. Renouvelez l’opération tous les deux jours en culture.

Remplacer le milieu de différenciation cardiaque contenant 10 mini molin de nicotinamide au huitième jour. Passer au milieu de différenciation cardiaque sans nicotinamide et continuer à renouveler le milieu tous les deux jours.

Environ deux semaines après le retrait de la nicotinamide, des cardiomyocytes battants commenceront à apparaître et à augmenter en nombre. La nicotinamide s'est révélée suffisante pour induire chez les cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans le système de culture défini une transition de la pluripotence vers un phénotype exclusivement cardiomésodermique. Lors de l'exposition de cellules souches embryonnaires humaines non différenciées à la nicotinamide, toutes les cellules de la colonie subissent des changements morphologiques en devenant de grandes cellules différenciées qui réduisent l'expression de OCT four. Ces cellules commencent également à exprimer le facteur de transcription spécifique au cœur NK X 2.5, ainsi qu'alpha-actinine.

Ces deux caractéristiques sont compatibles avec le phénotype de mésoderme cardiaque. Ces cellules différenciées continuent de se multiplier et augmentent de taille dans les zones des colonies où les cellules se sont accumulées. L'expression de NKX 2.5 est devenue plus intense. Après détachement, les cellules souches embryonnaires humaines traitées au nicotinamide ont formé des cardéoblastes en culture en suspension.

Après avoir laissé les précurseurs cardiaques s'attacher, ceux-ci ont été traités avec de la nicotinamide pendant une semaine ; un à deux semaines après le retrait de la nicotinamide, des cardiomyocytes battants ont commencé à apparaître avec une augmentation considérable de l'efficacité. Ils se présentaient sous forme d'agrégats cellulaires qui pulsaient avec des contractions rythmiques. La différenciation spontanée, multilignée, de cellules n'ayant pas subi le traitement IDE n'exprimait pas ces caractéristiques. Les cellules au sein des agrégats de cardiomyocytes battants exprimaient des marqueurs caractéristiques des cardiomyocytes, notamment NKX2.5 et l'alpha-actinine.

Les contractions des cardiomyocytes battants ont été confirmées par des profils électriques comme étant fortes, rythmées et bien synchronisées ; elles présentaient des impulsions régulières rappelant les complexes P-Q-R-S-T observés sur les électrodes de surface corporelle dans les électrocardiogrammes cliniques. De plus, les cardiomyocytes pouvaient conserver leur forte contractilité pendant plus de trois mois une fois la technique maîtrisée. Cette méthode peut être utilisée pour générer de manière uniforme des précurseurs cardiaques et des cardiomyocytes battants à partir de cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes en environ cinq semaines, si elle est correctement réalisée.