Overview
O espectrofotômetro é um instrumento rotineiramente utilizado em pesquisas científicas. Espectrofotometria é a medição quantitativa de quanto uma substância química absorve a luz passando um feixe de luz através da amostra usando um espectrofotômetro. Neste vídeo, conceitos básicos em espectrofotometria, incluindo transmissão, absorção e a Lei Beer-Lambert são revisados, além dos componentes do espectrotômetro. Esses conceitos fornecem uma base de como determinar a concentração de um soluto em solução capaz de absorver luz na faixa ultravioleta e visível. Além disso, é demonstrado um procedimento de como operar o espectrofotômetro, incluindo instruções sobre como em branco e medir a absorvência de uma amostra no comprimento de onda desejado. O vídeo também aborda como fazer uma curva padrão para determinação da concentração de analitos. Várias aplicações do espectrofotômetro em pesquisas biológicas são discutidas, como a medição da densidade celular e a determinação das taxas de reação química. Finalmente, o espectrofotômetro de microvolume é introduzido, bem como sua vantagem na medição da qualidade e quantidade de proteínas e ácidos nucleicos.
Procedure
O espectrofotômetro é um instrumento onipresentemente utilizado em pesquisas biológicas, químicas, clínicas e ambientais.
Espectrofotometria é a medição quantitativa de quanto uma substância química absorve a luz passando um feixe de luz através da amostra usando um espectrofotômetro.
Medindo a intensidade da luz detectada, este método pode ser usado para determinar a concentração de soluto na amostra.
O feixe de luz irradiado em direção à amostra é composto de um fluxo de fótons.
Quando os fótons encontram moléculas na amostra, as moléculas podem absorver algumas delas, reduzindo o número de fótons no feixe de luz e diminuindo a intensidade do sinal detectado.
A transmissão é a fração de luz que passa pela amostra e é definida como a intensidade da luz que passa pela amostra sobre a intensidade da luz incidente. A absorvência é o logaritmo inverso da transmissão e é a quantidade que seu espectrofotômetro irá medir.
A partir da absorvância, a concentração da solução amostral pode ser determinada a partir da Lei Beer-Lambert, que afirma que há uma relação linear entre a absorvância e a concentração de uma amostra. De acordo com a Lei Beer-Lambert, a absorvência é o produto do coeficiente de extinção, uma medida de quão fortemente um soluto absorve a luz em um determinado comprimento de onda, o comprimento que a luz passa através da amostra, ou comprimento do caminho, e a concentração de soluto. Muitas vezes, o objetivo de tomar medidas de absorção é medir a concentração de uma amostra.
Cada espectrofotômetro inclui uma fonte de luz, um collimador, que é uma lente ou dispositivo de foco que transmite um intenso feixe de luz reta, um monocromador para separar o feixe de luz em seus comprimentos de onda componentes, e um seletor de comprimento de onda, ou fenda, para selecionar o comprimento de onda desejado. Os comprimentos de onda da luz usados em espectrômetros discutidos neste vídeo estão na faixa ultravioleta e visível. O espectrômetro também inclui algum tipo de porta-amostras, um detector fotoelétrico, que detecta a quantidade de fótons que são absorvidos, e uma tela para exibir a saída do detector.
Os espectrômetros mais novos são diretamente acoplados a um computador, onde os parâmetros do experimento podem ser controlados e os resultados são exibidos.
Ao realizar espectrofotometria, certifique-se de tomar as precauções apropriadas, como usar luvas, dependendo do tipo de soluções biológicas ou químicas com as quais você está trabalhando.
Antes de medir o espectro UV visível de uma amostra, ligue a máquina e permita que as lâmpadas e eletrônicos se aqueçam.
Preparar um branco da mesma solução, mas sem o analito, tendo o mesmo pH e força iônica semelhante; um passo necessário, pois a célula e o solvente podem espalhar alguma luz.
Os tradicionais porta-amostras de espectrofotômetros são projetados para conter cuvetas de plástico e quartzo. Prossiga para pipeta a solução em branco na cuvette.
Depois de limpar quaisquer impressões digitais e derramar do lado de fora da cuvette, insira corretamente o cuvette no porta-múda e feche a porta para o compartimento de cuvette.
Nunca se esqueça de fechar a porta, pois a radiação UV emitida a partir de um espectrofotômetro aberto pode danificar os olhos e a pele.
Defina o comprimento de onda desejado ou o comprimento de onda a ser transmitido na amostra, que depende do comprimento de onda ideal de luz que o analito absorve. Em seguida, zero o instrumento tirando uma leitura do branco, que irá subtrair o fundo do seu buffer amostral.
Dependendo do tipo de experimento espectrofotométrico que você está realizando, pode ser necessário gerar uma curva padrão antes da medição da amostra, a partir da qual a concentração de seu analito amostral pode eventualmente ser determinada.
Deixe que a amostra atinja a temperatura apropriada e misture-a suavemente, para que as bolhas não sejam introduzidas. A amostra pode ser adicionada diretamente ao cuvette, dentro do instrumento, e uma leitura tirada.
Após a realização da medição de absorvência em sua amostra, proceda ao cálculo adequado para o seu experimento; por exemplo, determinação de concentração ou taxa de atividade enzimática.
O espectótmetro é usado diariamente em muitos laboratórios de pesquisa biológica.
Uma aplicação comum do espectótmetro é a medição da densidade celular. A medição da densidade celular é útil na geração de curvas de crescimento logarítmico para bactérias, a partir das quais o tempo ideal para indução de proteína recombinante pode ser determinado.
O espectotómetro também pode ser usado para medir taxas de reação química. Neste exemplo, a absorvência é usada para monitorar uma reação enzimática pelo desaparecimento de uma reação intermediária a 452 nm ao longo do tempo. A taxa desta etapa enzimática pode ser calculada encaixando os dados na equação apropriada.
Recentemente, a introdução de espectrofotômetros de micro volume eliminou a necessidade de portadores de amostras. Tais espectrofotômetros usam tensão superficial para segurar a amostra.
Os espectróficos de micro volume são ideais para medir a qualidade e concentração de amostras caras de volume limitado, como biomoléculas, incluindo proteínas e ácidos nucleicos.
A absorção de uma proteína a 280 nm depende do conteúdo de cadeias laterais aromáticas encontradas em triptofano, tyrosina e fenilalanina, bem como a existência de ligações de dissulfeto cisteína-cisteína.
A concentração proteica pode ser determinada a partir de sua absorção a 280 nm e seu coeficiente de extinção, que é baseado na composição do aminoácido.
Tanto o DNA quanto o RNA têm um máximo de absorção a 260 nm a partir do qual sua concentração pode ser determinada. A pureza do ácido nucleico também pode ser avaliada a partir da razão de leituras de absorvência em comprimentos de onda específicos.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao espectrômetro.
Neste vídeo, revisamos alguns princípios básicos, incluindo conceitos de espectrofotometria e componentes espectrotômetros. Também demonstramos o passo a passo do espectótmetro e discutimos seu uso em pesquisas biológicas. Obrigado por assistir.
Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
