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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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박테리아 형질변환: 열 충격 방법

Overview

변혁은 세포가 주변에서 외국 DNA를 섭취할 때 발생하는 과정입니다. 변형은 박테리아의 특정 모형에서 자연에서 생길 수 있습니다. 분자 생물학에서, 변환은 세균성 세포막에 있는 모공의 생성을 통해 실험실에서 인위적으로 재현됩니다. 환경에서 DNA를 취할 수있는 세균 세포는 유능한 세포라고합니다. 실험실에서, 세균성 세포는 열 충격 방법에게 불린 절차에 의해 나중에 소개된 유능하고 DNA를 만들 수 있습니다.

열 충격 변환은 염화칼슘이 제공하는 칼슘이 풍부한 환경을 사용하여 플라스미드 DNA와 세균성 세포막 사이의 정전기 반발을 중화시킵니다. 온도의 급격한 증가는 박테리아의 혈장 막에 있는 모공을 생성하고 플라스미드 DNA가 세균성 세포를 입력하는 것을 허용합니다. 이 비디오는 화학적으로 유능한 박테리아를 만들고, 열 충격 변환을 수행하고, 변형 된 박테리아를 플레이트하고, 변환 효율을 계산하는 방법에 대한 단계별 절차를 거칩니다.

Procedure

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세균성 변환은 외국 DNA가 박테리아로 도입되는 널리 사용되는 방법이며, 이는 DNA를 증폭하거나 복제 할 수 있습니다. 이 DNA를 쉽게 받아들일 수 있는 능력을 가진 세포는 유능한 세포에게 불립니다. 변화는 박테리아의 많은 모형에서 자연적으로 생기더라도, 과학자는 인위적으로 유도하고 세균성 세포의 능력을 강화하는 쪽을 찾아냈습니다. 이 비디오에서 우리는 이러한 방법 중 하나, 열 충격 변환에 대해 이야기 할 것입니다.

우리가 열 충격 기술에 관하여 말하기 전에, 먼저 세균성 변환에서 가장 일반적으로 이용되는 DNA의 모형을 토론해 봅시다: 플라스미드. 플라스미드는 세포막에서 모공을 쉽게 통과할 수 있도록 수퍼코일링으로 크기를 줄일 수 있는 작고 원형의 이중 가닥 DNA입니다.

플라스미드에는 언급할 가치가 있는 몇 가지 중요한 지역이 있습니다. 시판되는 플라스미드에는 여러 복제 사이트 또는 MCS가 포함되어 있습니다. 이 지역은 DNA를 갈라지는 제한 엔토뇌리스 또는 제한 효소에 의해 인식되는 특정 순서를 포함합니다. 플라스미드와 DNA 단편이 동일한 엔도클로 절단될 때 연구원에 대한 관심있는 DNA 단편을 여러 복제 부위에 삽입할 수 있습니다.

플라스미드에는 복제의 원산지(ORI)도 포함되어 있으며, 이 정보는 플라스미드의 복제가 시작되는 위치에 대한 정보를 셀에 제공합니다.

복제의 기원과 다중 복제 부위 외에도 대부분의 플라스미드에는 항생제 내성 유전자가 포함됩니다. 이 유전자는 플라스미드를 포함하는 모든 세포에 항생제 저항을 부여합니다, 그 세포가 항생제 를 포함하는 매체에서 살아남을 수 있도록.

이제 우리는 플라스미드에 대해 논의했습니다, 그들이 소개 될 세포에 대해 이야기 하자 : 유능한 세포. 분자 생물학 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 박테리아 유형과 변형은 대장균으로, 대장균은 대장균이 더 낮은 장에 거주합니다. 세포는 일반적으로 칼슘이 풍부한 환경에 노출을 통해 유능하게 만들어집니다.

칼슘 이온의 양전하는 플라스미드와 세균세포벽의 음전하를 중화하여 정전기 반발을 분산시키고 세포벽을 약화시다.

온도의 급격한 증가 또는 열 충격에 세포를 노출시킴으로써 세포의 외부와 내부 사이의 압력 차가 생성되어 모공의 형성을 유도하여 초응 플라스미드 DNA가 들어갈 수 있습니다. 세포를 정상 온도로 되돌리면 세포벽이 스스로 치유됩니다.

세포가 플라스미드를 차지하면 항생제로 묶인 한천 판에서 자랄 수 있습니다.

열 충격 변환을 시작하기 전에 작업 영역을 청소하고 모든 장비가 멸균되었는지 확인하십시오.

충분한 미디어와 한천이 준비되어 있는지 확인하여 박테리아에 영양을 공급하여 유능하게 만들 수 있습니다. 또한 오토클레이브를 통해 모든 솔루션을 소독해야 합니다. 액체 매체를 사용하기 전에 실온으로 식히고 한천을 50-55°C로 식히게 하고 항생제를 첨가하고 접시를 부어 줄 수 있습니다. 플레이트가 실온으로 냉각되어 고화되도록 합니다.

박테리아와 함께 작업 할 때, 하나는 항상 멸균을 유지하기 위해 무균 기술을 사용해야합니다. 무균 기술은 일반적으로 분젠 버너의 사용을 사용하여 계측기와 시약을 살균하고 대류 전류를 생성하는 것을 포함하며, 이는 공기 중 오염 물질을 작업 공간에서 벗어나게 합니다.

열 충격 반응 직전에 미디어를 실온및 항생제 함유 LB 한천 판을 37°C로 미리 데워줍니다. 또한 수조가 42 °C에 있는지 확인하십시오.

다음으로, 얼음에 화학적으로 유능한 세포를 해동.

세균 세포에 1ng/μL 냉소 의 1-5uL을 넣고 부드럽게 섞은 다음 세포와 플라스미드 혼합물을 30분 동안 얼음으로 돌려보냅니다.

시간이 되면 30초 동안 42°C의 수조에 배치하여 세포와 플라스미드 혼합물을 열충격을 가합니다.

수조에서 튜브를 꺼낸 직후 얼음위에 넣고 450μL의 미디어를 추가합니다. 셀이 회복될 수 있도록 225rpm 이상에서 1시간 동안 37°C의 흔들리는 인큐베이터에 놓습니다.

적절한 무균 기술을 사용하여 20-200uL 박테리아를 LB 한천 접시에 추가하고 박테리아 스프레더로 배지를 퍼뜨리습니다. 응축에 박테리아의 노출을 방지하기 위해 거꾸로 37 °C에서 하룻밤 접시를 배양.

다음 날, 플라스미드 형태의 식민지에서 찍은 박테리아.

다음으로, 식민지를 계산하여 변환 효율을 계산하는데, 이는 DNA 도금의 총 양으로 나눈 성공적인 변압제의 수입니다.

이제 식민지를 선택하여 추가 실험을 할 수 있습니다.

유능한 것으로 되기 전에 변형에 사용되는 박테리아는 냉동실에 저장됩니다. 그들은 얼음에 해동해야, 천판에 확산 – 항생제없이, 37 ° C에서 하룻밤 성장을 허용.

무균 기술을 사용하여, 한천 접시에서 세균 식민지를 선택하고 흔들리는 인큐베이터에서 37 °C에서 하룻밤 사이에 큰 500ml 문화권에서 자라며 박테리아의 퇴적물과 심지어 매체의 영양소 분산을 방지합니다.

세포가 성장하는 동안 0.1 대구칼슘과 0.1 어금니 칼슘 염화물 플러스 15% 글리세롤 솔루션, 오토클레이브, 식힙니다.

흡수성 측정은 박테리아가 성장의 중간 로그 단계에 있는지 여부를 결정하는 데 사용되며, 이는 DNA를 쉽게 차지할 것입니다. 세포가이 단계에 도달하면, 얼음에 배치하고 절차 전반에 걸쳐 거기에 보관.

다음으로 세균 세포를 두 개의 큰 원심분리기 튜브로 분리하고 4°C에서 회전합니다. 상체를 붓고 차가운 칼슘 염화물 의 약 100ml 0.1 어금니에 다시 중단합니다. 그런 다음 얼음에 세포를 30 분 동안 배양합니다. 이 단계는 적어도 한 번 더 반복됩니다. 회전 및 재중단 세포의 주기는 종종 세포를 세척이라고합니다.

마지막 세척 후, 감기 50mL 0.1 대구칼슘과 15% 글리세롤 용액으로 세포를 재차 리펜시합니다. 이 세포는 지금 화학적으로 유능합니다.

50μL의 박테리아를 여러 미세 분리 튜브에 분배하고 열 충격이 준비될 때까지 -80°C에 보관하십시오.

세균 변환의 많은 응용 프로그램 및 변형이 존재합니다.

열 충격 이외에, eletroporation 변환을 위한 또 다른 일반적인 기술입니다. 그것은 이름으로 전기 기공 DNA통과 수 있는 세균성 세포막에 있는 기공을 만들기 위하여 전기를 사용하는 관련시킵니다.

변형 된 박테리아에 대한 스크리닝과 관련하여 플라스미드는 종종 스크리닝을 돕기 위해 효소 베타-갈라토시다아제인코딩 유전자를 함유하고 있습니다. 이 효소의 기질이 천판에 포함될 때, 인서트 수율을 함유한 플라스미드로 변형된 박테리아는 그렇지 않은 반면, 푸른 식민지를 산출합니다. 이 방법을 파란색 및 흰색 스크리닝이라고 합니다.

대부분의 변환 실험에서 목표는 대상 유전자를 포함하는 플라스미드의 대량을 만들기 위해 박테리아를 빠르게 나누는 것입니다. 세균성 변형에 따라, 다음 단계는 항생제 함유 액체 배지에서 다량의 박테리아를 자라서 플라스미드 정제를 수행하는 것입니다. 이러한 목적을 위해 많은 상용 키트를 사용할 수 있습니다.

때때로 변환의 목표는 박테리아가 플라스미드에 의해 인코딩 된 많은 양의 단백질을 생성하도록하는 것입니다. 여기서 세균세포가 균질화되고 용해되는 것을 볼 수 있으며, 친화 정화라는 기술이 표적 단백질을 분리하기 위해 수행될 수 있다. 다량의 단백질을 정화한 후 특정 단백질의 결정화 및 구조를 확인할 수 있다.

당신은 열 충격 변환에 조브 소개를 보았다. 이 비디오에서 우리는 검토: 어떤 열 충격 변환이며 어떻게 작동하는지, 그 뒤에 있는 주체및 박테리아를 성공적으로 변화시키는 방법. 시청해 주셔서 감사합니다!

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