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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Overview

효소-연결된 면역흡소감 분석(ELISA)은 전형적으로 실험 샘플 내에서 관심있는 표적 단백질의 존재 및/또는 양을 검출하기 위해 수행됩니다. 표적 단백질의 검출은 ELISA를 면역 분석으로 만드는 항체에 의해 가능하게 된다. 일련의 인큐베이션 및 세척 단계를 통해, 자주 연결되거나 효소에 공주되는 이러한 항체는 마이크로티터 플레이트에 우물의 바닥을 코팅하는 단백질을 검출합니다. 기판에 노출되면, 항체 결합 효소는 색 변화를 일으켜 시료에 대한 관심 있는 단백질의 존재를 나타낸다.

이 비디오에서, ELISA작동 방법의 이론은 1 차 및 이차 항체 결합 둘 다의 토론 및 차단 단계의 중요성을 포함하여 설명됩니다. 비디오가 단계별 절차에 대한 설명으로 진행됨에 따라 이론은 연습에 뒤따릅니다. 마지막으로, 샌드위치와 경쟁적인 ELISA와 같은 표준 ELISA의 변형이 도입되고, 창구 판매 임신 검사와 같은 이 방법의 실제 응용 프로그램이 설명된다.

Procedure

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상기 ELISA, 또는 효소-연결된 면역흡소벤트 분석법은, 특정 표적 단백질의 존재 또는 부재를 결정하는 널리 사용되는 방법입니다.

일련의 세척 및 결합 단계를 통해, 항체가 공주하거나 효소에 연결되어 96웰 플레이트의 바닥에 표적 단백질을 인식하게 된다. 기판이 시료에 첨가되면 효소 반응이 발생하여 표적 단백질의 식별 및 정량화를 허용하는 색 변화가 발생합니다.

ELISA를 수행하는 방법에 대해 논의하기 전에 필요한 장비와 시약에 익숙해지겠습니다.

ELISA 반응에 대한 설정은 일반적으로 96웰의 평평한 바닥 플레이트입니다. 우물의 평평한 바닥은 실험 용 샘플뿐만 아니라 캡처 및 검출 항체의 균일한 분포를 용이하게하는 데 도움이됩니다.

ELISA는 실험용 수성 용액에서 특정 표적 단백질의 존재를 감지합니다. 소변, 세포 배양 배지 및 혈청은 일반적인 실험 샘플입니다.

ELISA에서 표적 단백질에 직접 결합하는 항체는 1차 항체이다. 그것은 높은 친화력, 즉, 대상 단백질의 특정 영역인 에피토프를 위해 단단히 결합하는 높은 능력을 가지고 있습니다. 1 차적인 항체는 일반적으로 표지되지 않거나, 또는 공주되지 않습니다.

언급 한 바와 같이, 항체는 주로 특정 에피토프에 결합 높은 친화성을 통해 그들의 표적 단백질에 결합합니다. 그러나, 실험용 샘플은 비특이적 결합 부위를 발현하는 세포의 조각, 검출기 항체의 상수 또는 비에피토프 특정 영역을 결합할 수 있는 부위를 포함할 수 있다.

따라서 실험 샘플의 비특이적 결합 사이트를 커버하려면 ELISA에서 차단 버퍼를 추가하는 것이 필수적입니다. 그렇지 않으면 당신은 당신에게 거짓 긍정적 인 데이터를 제공, 대상 단백질을 포함하지 않는 우물에서 발생하는 효소 반응을 가질 수있다!

ELISA내의 이차 항체는 1차 항체를 인식하는 데 사용되는 항체이다. 이 항체는 일반적으로 효소에 공해됩니다. 때때로 이차 항체는 펑키한 이름을 가지고 있습니다. 예를 들어, 이차 항체가 염소에서 자란 1차 항체를 인식하기 위해 당나귀에서 만들어지거나 제기되는 경우, 이차 항체는 당나귀 항염소 항체라고 할 것이다. 이차 항체의 이름을 지정할 때, 이름은 이차 항체를 생성한 유기체를 나타내고, 두 번째 이름은 1차 항체를 생성하는 유기체를 나타낸다.

이차 항체에 연결된 효소의 활성 부위에 결합하는 기질도 필요할 것이다. 이 반응 중에 발생하는 화학 반응은 그렇지 않으면 무색 기판의 색 변화를 일으킵니다. 이 소위 착색 분석법은 표적 단백질의 존재를 식별하고 정량화할 수 있게 합니다.

효소 반응은 사용 가능한 기판이 있는 한 계속됩니다. 따라서 잠깐 의복기 후에, 반응이 실제로 중단되었음을 나타내는 또 다른 색 변화를 일으키는 정지 용액이 우물에 추가됩니다.

마이크로 플레이트 판독기는 각각의 우물에서 흡광도, 즉 유색 제품의 양을 읽음으로써 각 우물에 관심 있는 단백질의 농도를 정량화하는 데 사용됩니다. 흡광도는 존재하는 표적 단백질의 양에 비례한다.

이제 모든 장비를 준비했습니다, ELISA를 실행합시다!

표준 또는 직접, ELISA를 수행하기 위해, 먼저 코팅 버퍼에 희석 관심의 목표 단백질과 96 웰 플레이트의 우물을 코팅. 이 때에도 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 플레이트.

코팅 된 플레이트를 충분히 길게 배양 한 후 단백질시간을 완전히 흡착하거나 접시 바닥에 부착할 수 있으며 손목의 빠른 플릭으로 과도한 코팅 용액을 덤프하십시오.

그런 다음 버퍼 차단에 각 우물을 인큐베이팅하여 가능한 비특이적 바인딩 또는 배경 신호를 차단합니다.

이제 차단 버퍼를 덤프하고 인산염 완충 식염수, 또는 PBS, 및 1 % BSA에서 짧은 실온 인큐베이션으로 우물을 세척합니다.

우물은 PBS로 헹구는 동안, 표준 곡선을 만들기 위하여 표적 단백질의 알려진 농도의 희석을 준비합니다. 표적 단백질의 알려진 농도를 포함하는 표준 곡선 우물의 흡수도는, 표준 곡선 우물의 흡수에 대한 샘플 우물의 흡수도의 비교에 기초하여 실험샘플 우물에서 표적 단백질의 농도를 계산하는 데 사용될 것이다.

이제 검출 또는 1 차 항체를 추가 할 때입니다!

플레이트는 일반적으로 실온에서, 단백질의 나중에 검출 및 정량화를 위해 표적 단백질에 결합하는 항체의 충분한 양을 허용하기 위하여 배양됩니다.

이 배양 후, 과잉 항체가 제거되고 우물은 PBS로 간략하게 세척됩니다.

이차 항체는 그 때 접시에 추가되고, 플레이트는 다시 한 번 배양됩니다 – 일반적으로 회전 플랫폼에 - 이차 항체가 결합할 수 있도록 합니다. 세탁 단계는 이전과 같이 반복됩니다.

다음으로, 접시에 기판을 추가하여 대상 단백질을 포함하는 우물을 확인합니다. 플레이트를 덮어 빛으로부터 반응을 보호한 다음 잠깐 인큐베이션 한 후 정지 용액으로 반응을 중단합니다.

마지막으로, 마이크로 플레이트 판독기에 접시를 배치하여 각 우물에서 색용액의 흡광도 또는 양을 측정합니다. 독자가 분석할 우물을 선택해야 합니다. 악기가 접시를 읽는 작업이 끝나면 각 우물에 대한 흡광도 판독이 표시됩니다.

각 ELISA 키트에는 감지 제한이 있습니다. 즉, 특정 한도 보다 높은 단백질 농도만 정확하게 결정할 수 있다. 단백질의 아주 작은 농도는 일반적으로 비 특이적인 얼룩의 배경 수준에 너무 가깝습니다, 아주 높은 농도는 과잉 단백질 또는 항체가 그 견본에서 제대로 씻겨 지지 않았다는 것을 나타낼 수 있는 동안.

그렇다면 왜 ELISA를 수행할 수 있을까요? 몇 가지 일반적인 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

아마도 ELISA가 수행 한 가장 일반적인 유형은 샌드위치 ELISA입니다.

샌드위치 ELISA에서, 96 웰 플레이트는 관심의 표적 단백질을 인식하는 1 차적인 항체로 먼저 코팅됩니다.

본 실험에서, 인간 항체 생산 세포주에서 수확된 세포 배양 배지는 인간 항체를 인식하는 1차 항체로 미리 코팅된 96웰 플레이트에 자동화된 시스템에 의해 도금되었다.

PBS로 과잉 시료를 씻어낸 후 효소와 연결된 이차 항체가 추가되고 착색성 기판이 추가됩니다.

흡광도는 일반적인 ELISA와 동일한 방식으로 측정됩니다. 예를 들어, 본 실험에서, 본 ELISA 데이터는 표적 항원에게 정확하게 결합하는 가장 좋은 능력인 가장 높은 친화력을 가진 인간 항체를 생성하는 세포주를 결정하는 데 사용될 것이다.

창구 판매 임신 테스트는 샌드위치 ELISA의 한 유형입니다.

잠재적으로 임신 한 여성의 소변이 시험에 추가되면, 시험에 부착 된 효소 연결 1 차 적인 항체는 그것이 존재하는 경우에 임신 호르몬 hCG를 결합할 것입니다. 여성이 임신한 경우, 1차 항체가 시험 현장에서 기판 결합 이차 항체에 의해 인식될 때 기판-enyzme 반응이 발생하고, 유색선이 나타날 것이다.

ELISA의 또 다른 유형은 항체의 존재를 검출하는 데 사용할 수있는 경쟁 ELISA입니다.

관심 있는 항체가 시료에 존재하는 경우에, 그(것)들은 판의 바닥에 붙어 있는 표적 단백질에 결합할 것입니다. 나중에, 효소 연결 검출 항체가 접시에 추가될 때, 효소 연결 항체는 결합하는 단백질이 거의 없을 것입니다; 그들은 실험 샘플에 대한 관심의 항체에 의해 "아웃 경쟁"되었을 것입니다.

경쟁 ELISA에서, 다음, 착색 우물은 실제로 관심의 항체를 포함하지 않는 샘플을 나타냅니다! 환자 혈장 샘플은 전형적으로 HIV 바이러스와 같은 특정 병원체에 대한 항체가 샘플에 존재하는지 확인하기 위해 경쟁ELISA에서 실행됩니다.

당신은 ELISA 를 수행하는 JoVE 소개를 보았다. 이 비디오에서 우리는 검토: ELISA는 무엇이고 어떻게 작동하는지; 수행할 장비 및 시약 및 ELISA; 그리고 분석의 일부 다른 응용 프로그램. 보고 주셔서 감사합니다, 당신의 기판이 과도하게 개발하지 못하게 기억!

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