Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

טיהור פלסמיד

Overview

טיהור פלסמיד הוא טכניקה המשמשת לבודד ולטהר דנ"א פלסמיד מדנ"א גנומי, חלבונים, ריבוזומים ודפנות התא החיידקי. פלסמיד הוא דנ"א קטן, מעגלי, כפול גדילים המשמש כנשא של מולקולות דנ"א ספציפיות. כאשר הוא הוכנס לאורגניזם מארח באמצעות טרנספורמציה, פלסמיד ישוכפל, וייצור עותקים רבים של שבר הדנ"א הנחקר.

בסרטון וידאו זה, הליך כללי שלב אחר שלב מתואר כיצד לבצע טיהור plasmid. טיהור Plasmid כולל שלושה שלבים בסיסיים: צמיחת תרבית החיידקים, קצירה ותמיסה של החיידקים, וטיהור ה- DNA הפלסמיד. הסרטון מכיל הסבר שבו ניתן למצוא את הפלסמיד בכל שלב בפרוטוקול ולנתח באופן כמותי ואיכותי DNA פלסמיד עם ספקטרופוטומטר ו /או אלקטרופורזה ג'ל. ישנם סוגים שונים של שיטות טיהור plasmid זמין, אשר מכוונים לתשואה הרצויה, מספר עותק plasmid, ונפח תרבות חיידקים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פלסמידים הם מעגליים, כרומוזומאליים נוספים, מולקולות דנ"א וביולוגיה מולקולרית הם פועלים כנשאים, או וקטורים, עבור שבר דנ"א ספציפי. חיידקים משמשים לשכפול פלסמידים, כך שהדנ"א שלך מעניין בייצור המוני. התהליך שבו חוקרים משיגים פלסמידים מחיידקים נקרא טיהור פלסמיד, אשר יוסבר בסרטון זה.

ברור, טיהור plasmid כרוך טיהור plasmids, אבל מה זה אומר בדיוק? כדי לטהר פלסמידים, הם חייבים להיות מבודדים מן כרומוזום חיידקי, חלבונים, קרום חיידקי, ריבוזומים חיידקיים.

למרות שקיימות ערכות רבות ושונות לטיהור פלסמידים, העיקרון הבסיסי מאחורי טיהור plasmid נשאר זהה לכולם. ראשית, מושבת החיידקים שנבחרה גדלה במדיה תרבותית מתאימה המכילה את האנטיביוטיקה הנכונה. הודות לגן עמיד לאנטיביוטיקה, המקודד על ידי הפלסמיד, רק חיידקים המכילים את הפלסמיד יגדלו בתקשורת זו. החיידקים נקצרים ומתכוונים תחת pH גבוה. ה- pH מנוטרל, מוסיפים מלח, ואז התערובת מסובך למטה כדי להסיר פסולת ודנ"א גנומי.

ליסאט תא מנוטרל נוסף לעמודת סיליקה. DNA Plasmid הוא האמין לדבוק בעמודה באמצעות מנגנון שנקרא חילופי אניון, שבו DNA, אניון חזק, נקשר לעמוד טעון שלילית באמצעות גשר מלח קטיונים. חומר אחר מן lysate, כגון חלבונים, נשטפים דרך העמודה עם מאגרי מלח גבוהים. לבסוף, פלסמיד מטוהר משתחרר מהעמוד כאשר מאגר מלח נמוך מתווסף לשבש את גשר המלח.

עבור הליך זה יש ללבוש חלוק מעבדה, כפפות חד פעמיות ומשקפי מגן.

תרביות החיידקים, אשר משתנים עם ה- DNA plasmid הרצוי, צריך להיות גדל בן לילה בתקשורת הצמיחה עם אנטיביוטיקה מתאימה אינקובטור רועד 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, תרבית החיידקים מגולגלת על ידי צנטריפוגה והסופרנט מוסר. הכדור הנותר הוא respended במאגר תמיסת.

לאחר resuspended, חיידקים ניתן להעביר צינור קטן יותר שבו מאגר תמיסת מתווסף. מאגר ליזה יש pH גבוה ומכיל דטרגנטים, כגון נתרן דודציל סולפט, אשר לשבש את ממברנות החיידקים, ובכך ליסינג החיידקים. הפתרון יהפוך מעונן עם תוספת של מאגר תמה ולאחר ערבוב הפתרון הופך ברור יותר. התערובת לא צריכה להיות מערבולת בשל האפשרות של גיזום, או פירוק, DNA גנומי, אשר לאחר מכן יכול לזהם טיהור DNA plasmid.

לאחר מכן, מאגר נטרול נוסף כדי לנטרל את התנאים האלקליין ולהוריד את ה- pH. עם דנ"א גנומי ערבוב עדין, כמו גם כל חלבונים הקשורים אליו יהיה לזרז, בעוד DNA plasmid יישאר בתמיסה. שוב להימנע מערבולת, כך כמו plasmids שלך חופשיים זיהום DNA גנומי.

לאחר מכן, התערובת צנטריפוגה והמזרז של הדנ"א/חלבון הגנומיים מטלטל. הסופר-נט מכיל את הדנ"א הפלסמי, כמו גם חלבונים מסיסים.

סופר-נט זה ממוקם על העמוד על ידי decanting, שם מפואר לשפוך אותו, או pipetting. הכדור יכול להיות מושלך.

לאחר מכן, חוצץ שטיפת מלח גבוה עובר דרך העמוד בעוד ה- DNA נשאר קשור לסיליקה. צעדי כביסה חוזרים ונשנים עם חיץ מלח גבוה מסירים אנדונוקלאזים, רנ"א, חלבונים, צבעים וזיהומים במשקל מולקולרי נמוך. יש להשליך את הזרימה של שלבי הכביסה. לאחר שלב הכביסה הסופי ודאו שהמסנן יבש לחלוטין ללא כל חיץ שנותר. הדנ"א של הפלסמיד עדיין ממוקם על המסנן.

הדנ"א הפלסמידי מלוטץ במים סטריליים או במאגר חצץ. הדנ"א זמין לשימוש מיידי במגוון רחב של יישומים.

ישנן מספר דרכים לאמת את טוהר הפלסמידים לאחר הטיהור. ספקטרומטר יכול לשמש כדי להשוות ספיגה לאורכי גל שונים כדי לקבוע את הריכוז של DNA plasmid. ניתוח ג'ל אגרוז של plasmid מטוהר יכול לקבוע אם plasmid הוא בגודל הנכון ואין מזהמים. שלב זה מבטיח שאין זיהום דנ"א גנומי והפלסטיד לא השתנה בחיידקים.

ניתן לשנות את הליך הטיהור של פלסמיד כך שיתאימו לגדלי פלסמיד שונים, מספר העתקה, נפח תרבות, והוא יכול לכלול ציוד שונה לשלבי הכריכה, הכביסה וההתלבטות. התשואה היא במקרה אחת ההבחנות הבולטות בין ההכנות הפלסמידיות ולעתים קרובות הן מחולקות למיני-הכנה, או המיני-הכנה, המידי-פר, מקסימום ומגה-הכנה בהתאם לתשואה הרצויה.

במונחים של יישומים במורד הזרם, הליך אחד שבדרך כלל עוקב אחר טיהור plasmid הוא transfection, אשר כרוך בהכנסת DNA plasmid לתוך תאים אאוקריוטים. לעתים קרובות המטרה של ניסוי טרנספקטיון היא לדמיין את המבנה של תאים ורקמות עם חלבונים עיתונאיים, כגון אלה המתייגים את הנוירונים בתמונות שאתה רואה כאן.

לפעמים plasmids מרובים מטוהרים על ידי מספר הכנות טיהור ניתן להכניס לתוך אותם חיידקים, ובכך לשחזר מסלול biosynthetic שלם באמצעות הייצור של מספר אנזימים מקודדים על ידי plasmids. התוצאה הסופית היא ייצור של תרכובת מורכבת, כמו האנטיביוטיקה שאתם רואים כאן, ליד התא.

פלסמידים מטוהרים עשויים להיות מוחזרים לחיידקים, על מנת ליצור כמויות גדולות של חלבון המקודד על ידי plasmid. כאן אתה רואה תאים חיידקיים להיות הומוגניים lysed לפני טכניקה הנקראת טיהור זיקה יכול להתבצע כדי לבודד את חלבון היעד. חלבון מטוהר מתגבש ומבנהו מזוהה לאחר מכן.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לטיהור פלסמיד. בסרטון זה דנו בעקרונות הבסיסיים העומדים מאחורי שיטה זו, בתיאור צעד אחר צעד, וב קומץ יישומים של הכנת הפלסמיד שלך. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter