Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

הכתם המערבי

Overview

סופג מערבי משמש לזיהוי נוכחות של חלבונים ספציפיים בדגימות מופרדות אלקטרופורטית. בעקבות הפרדה על ידי טכניקה המכונה נתרן דודסיל סולפט polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה, או SDS-PAGE, העברה מערבית משמשת להעברת חלבונים מג'ל polyacrylamide על פיסת ממברנה אשר לוכד את החלבונים במקומות המתאימים שלהם. לאחר מכן, הממברנות נבדקות עם נוגדנים בתהליך שנקרא אימונובלוט. אימונובלוטינג משתמש בחלבון נוגדנים ונוגדנים מחייבים דרך אתרי זיהוי ספציפיים, ומספקים את הספציפיות הגבוהה הנדרשת לזיהוי חלבון יחיד. איתור הנוגדנים מתבצע באמצעות מערכות עיתונאיות הכוללות שימוש באנזימים. אנזימים יכולים להיות מחוברים לסוף נוגדן ולהגיב עם מצעים כדי לייצר שינויים בצבע או באור. לאחר מכן ניתן לדמיין אותות אלה ולכימת באמצעות תהליך הנקרא densitometry.

מאמר וידאו זה מציג סקירה כללית של טכניקת הכתם המערבי על ידי תיאור העברה מערבית, שימוש בזיהוי נוגדנים וניתוח תמונה. השלבים הכרוכים בהעברה מערבית כגון הרכבת כריך ההעברה ותנאי ההעברה נדונים בפירוט, כמו גם התיאוריה שמאחורי כריכת הנוגדנים וזיהוי נוגדנים אלה. היישומים הרחבים של טכניקה זו מתוארים באמצעות מספר דוגמאות, כולל זיהוי של אינטראקציות חלבון חלבון וזיהוי של חלבונים בודדים בתוך מתחמי חלבון.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

סופגת מערבית היא טכניקה רבת עוצמה המשמשת חוקרים רבים כדי לזהות את נוכחותם של חלבונים ספציפיים במדגם המופרד אלקטרופורטית באמצעות נוגדנים.

ישנם 3 שלבים עיקריים של טכניקה זו החיוניים לתוצאה איכותית: אלקטרובלוטינג, אימונובלוטינג וזיהוי. לפני שלבים אלה מנסים, SDS-PAGE, שבו חלבונים denatured מופרדים לפי גודל ג'ל polyacrylamide, חייב להתבצע.

Electroblotting, ידוע גם בשם המערב "העברה" ודורש קלטת העברה עבור החזקת יחד "כריך" כמו גם מנגנון להעברת חלבון מג'ל אקרילימיד לממברנה דקה. כריך ה- electroblotting מורכב מהג'ל וממברנה מיוחדת, בין שתי חתיכות נייר סינון. במהלך ההעברה, שדה חשמלי משמש, כדי להעביר את החלבונים דרך הג'ל, שם הם נלכדים על ממברנה בשל אינטראקציות טעונות והידרופוביות.

אימונובלוטינג משתמש בנוגדנים כדי "לחקור" את הממברנה לחלבונים ספציפיים. נוגדנים הם חלבונים גדולים בצורת Y המכילים שני שברים, הידועים גם בשם אזורי Fab, אשר נקשרים לחלבונים אחרים. אזור Fab מגדיר את האפיטופ הספציפי, או חלק מסוים של חלבון, שאליו נוגדן ייקשר.

נוגדנים חד שבטיים הם נוגדנים המזהים אפיטופ יחיד והם סוג הנוגדנים המועדף המשמש לחיסון בשל הספציפיות שלהם. לעומת זאת, נוגדנים פוליקלונליים הם סדרה של נוגדנים שונים המכוונים לאפיטופים רבים על אותו אנטיגן – או חלבון שעבורו לנוגדן יש ספציפיות. נוגדנים חד שבטיים המזהים אפיטופ ליניארי עדיפים שכן זה מבטיח את האפיטופ ניתן למצוא על חלבון denatured, או ליניארי. זה חשוב כי נוגדנים רבים מזהים רק אפיטופים קונפורמייתיים, מה שאומר שהם מזהים חלבונים במצבם בתלת-ממד בלבד.

בנוסף לרסיסי Fab, נוגדנים מכילים אזור Fc, שהוא ספציפי לחיה שהפיקה את הנוגדן. בחיסון, אזור זה משמש בעיקר כאפיטופ לנוגדן משני – נוגדן המזהה את הנוגדן הראשון שקשר לחלבון שאתם מנסים לזהות.

על מנת לייצר אות נצפה, נוגדנים מקושרים לעתים קרובות, דרך אזור Fc שלהם, לאנזים עיתונאי, כגון פוספטאז אלקליין או peroxidase חזרת. אנזימי כתב אלה מייצרים אותות על ידי תגובה עם מצעים כדי לגרום לשינויי צבע או לייצר שינויי אור.

לאחר מכן ניתן לכמת שינויים אלה באמצעות densitometry. Densitometry היא הטכניקה המשמשת למדידת הצפיפות של רצועת חלבון באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כדי לחשב את הצפיפות של כל רצועה. לאחר מכן ניתן לכמת את הרצועות ישירות באמצעות תקני הפניה או בשליטה פנימית באמצעות דגימת בקרה.

עבור העברה מערבית מוצלחת, הג'ל הוא הראשון שיווי משקל במאגר העברה במשך 15 דקות. הממברנה צריכה להיות גם מכויל על פי הוראות ייצור.

לאחר מכן, כריך העברת ג'ל מוכן בקפידה במאגר העברה כדי למנוע בועות מלהיות לכוד בתוך המערכת. בועות לכודות בכריך ניתן לכפות על ידי גלגול עליהם עם פיפטה קטנה. אפילו בועות קטנות יכולות להפריע להעברת חלבונים הגורמים להעברה לא שלמה כפי שניתן לראות בחלקים התחתונים של קרום זה.

לאחר ההרכבה, מאגר העברה נוסף נשפך לתוך תא ההעברה והוא מופעל ב 20-30 mA במשך 2-3 שעות. חיץ ההעברה מכיל מתנול, אשר משפר את כריכת החלבונים לממברנה.

לאחר השלמת ההעברה הקלטת מפורק ואת איכות ההעברה ניתן לבדוק באמצעות כתם חלבון לא ספציפי כגון Ponceau S. זה מציע זיהוי מהיר וה הפיך של רצועות חלבון.

הצעד הראשון של אימונובלוטינג הוא לכסות את האזורים הנותרים של הממברנה עם פתרון מדלל של חלבונים. שלב זה נקרא חסימה ובוצע, על מנת לחסום את הממברנה ולהפחית את הכריכה הלא-מדעית של הנוגדן לממברנה. בדרך כלל, פתרון החסימה מורכב אלבומין סרום בקר או חלב יבש ללא שומן מומס בתמיסת תמיסת מלח חוצץ. שלב זה נעשה בדרך כלל במשך שעה עד לילה על שייקר.

השלב הבא הוא לדגור על הממברנה עם הנוגדן העיקרי מדולל בתמיסת החסימה. שלב זה יכול לקחת מ 30 דקות עד לילה צריך להתבצע עם עצבנות עדינה.

לאחר מכן, הממברנה נשטפת ביסודיות כדי להפחית כתמי רקע לא-מיניים והנוגדן המשני מתווסף בחסימת חוצץ לממברנה. לאחר דגירה קצרה, הממברנה שוב נשטפת ביסודיות.

נוגדנים משניים ניתנים לזיהוי הודות לאנזימי הכתבים קשורים אליהם. עם הוספת המצע הנכון, ניתן לדמיין שינויים צבעוניים או כימותרפיים ולאחר מכן למדוד באמצעות טכניקות צפיפות. בנוסף, סולם החלבון מספק התייחסות בגודל יקר ערך, כך שניתן להעריך את גודלו הליניארי של כל חלבון בהתבסס על כמה רחוק הוא עבר בג'ל ביחס לסמני הגודל בסולם. התבוננות בגודל החלבונים שזוהו באמצעות אימונובלוטינג היא דרך טובה לוודא כי הנוגדן מזהה את החלבון הנכון והאם הוא מונומר או עותקים מרובים של החלבון הנראים.

ישנם אלפי נוגדנים ראשוניים זמינים מסחרית, המאפשר זיהוי וכימות של חלבונים ספציפיים בתוך מדגם. כאן חוקר משתמש בנוגדן עבור HIF-1α כדי למדוד את כמות גורם שעתוק תגובתי חמצן זה תרביות תאים כדי לסנן היפוקסיה. הם גם השתמשו בנוגדן עבור בטא-אקין כדי לשמש כבקרה טעינה. כפי שניתן לראות, התאים בתרבית בתנאי חמצן רגילים המיוצרים הרבה פחות HIF-1 מאלה בתרבית בתנאי חמצן נמוכים.

השילוב של אלקטרופורזה ג'ל 2D וחיסון יכול לספק מידע רב ערך לנוכחות של מתחמי חלבון. כאן, דגימות בוצעו תחילה על ידי גודל מורכב חלבון, ולאחר מכן denatured כך כל חלבון בודד בקומפלקס יכול להיות מופרד על ידי הגודל האישי שלהם. נוגדנים לשלושה חלבונים שונים מראים שלוש סיווחים ייחודיים המכילים מספרים שונים של חלבונים אלה כאשר כל קומפלקס מסודר בקו אנכי. העמודה השמאלית ביותר מכילה בטא-2 ו- MCP-21, כמו גם חלבון אחר שאינו מוצג על ידי סמנים אלה. העמודה המרכזית מציגה קומפלקס שהכיל את כל 3 החלבונים, והעמודה הימנית הכילה רק בטא-2 ו- MCP-21.

אימונובלוטינג יכול לשמש גם כדי לדמיין אינטראקציות חלבון חלבון. זה מבוצע על ידי העברת חלבונים תחילה מג'ל על קרום ניטרוצלולוז ולאחר מכן לחקר קרום זה עם חלבונים נוספים. אימונובלוטינג משמש לאחר מכן כדי לזהות אם החלבונים הנוספים מורכבים עם כל החלבונים שהיו משותקים על הממברנה.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על חיסונים. עכשיו אתה צריך להבין איך להעביר חלבונים לממברנה, לחקור את הממברנה עם נוגדנים, ולזהות את האות. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter