Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Overview

Western Blotting viene utilizzato per identificare la presenza di proteine specifiche in campioni separati elettroforeticamente. Dopo la separazione con una tecnica nota come elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio, o SDS-PAGE, il trasferimento occidentale viene utilizzato per spostare le proteine da un gel di poliacrilammide su un pezzo di membrana che intrappola le proteine nelle rispettive posizioni. Successivamente, le membrane vengono sonde con anticorpi in un processo chiamato immunboblotting. L'immunoblotting utilizza il legame anticorpo-proteina e anticorpo-anticorpo attraverso specifici siti di riconoscimento, fornendo l'elevata specificità necessaria per identificare una singola proteina. La rilevazione degli anticorpi avviene utilizzando sistemi reporter che includono l'uso di enzimi. Gli enzimi possono essere attaccati all'estremità di un anticorpo e reagire con i substrati per produrre cambiamenti di colore o luce. Questi segnali possono quindi essere ripresi e quantificati utilizzando un processo chiamato densitometria.

Questo video-articolo presenta una panoramica della tecnica western blot descrivendo il trasferimento occidentale, l'uso del rilevamento degli anticorpi e l'analisi delle immagini. I passaggi coinvolti nel trasferimento occidentale come l'assemblaggio del sandwich di trasferimento e le condizioni di trasferimento sono discussi in dettaglio, nonché la teoria alla base del legame anticorpale e il rilevamento di tali anticorpi. Le ampie applicazioni di questa tecnica sono descritte attraverso diversi esempi tra cui la rilevazione di interazioni proteina-proteina e l'identificazione di singole proteine all'interno di complessi proteici.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Il Western Blotting è una potente tecnica utilizzata da molti ricercatori per identificare la presenza di proteine specifiche in un campione separato elettroforeticamente utilizzando anticorpi.

Ci sono 3 fasi principali di questa tecnica che sono essenziali per un risultato di qualità: elettroblotting, immunoblotting e rilevamento. Prima di tentare queste fasi, è necessario eseguire SDS-PAGE, in cui le proteine denaturate sono separate per dimensione in un gel di poliacrilammide.

L'elettroblotting, è anche noto come il "trasferimento" occidentale e richiede una cassetta di trasferimento per tenere insieme il "sandwich" e un apparato per trasferire proteine da un gel acrilimide a una membrana sottile. Il sandwich elettroblotting è costituito dal gel e da una membrana specializzata, inserita tra due pezzi di carta da filtro. Durante il trasferimento, viene utilizzato un campo elettrico, per spostare le proteine attraverso il gel, dove rimangono intrappolate su una membrana a causa di interazioni cariche e idrofobiche.

L'immunoblotting utilizza anticorpi per "sondare" la membrana alla rinfazione di proteine specifiche. Gli anticorpi sono grandi proteine a forma di Y che contengono due frammenti, noti anche come regioni Fab, che si legano ad altre proteine. La regione Fab definisce l'epitopo specifico, o porzione specifica di una proteina, a cui si legherà un anticorpo.

Gli anticorpi monoclonali sono anticorpi che riconoscono un singolo epitopo e sono il tipo di anticorpo preferito utilizzato per l'immunoblotting a causa della loro specificità. Al contrario, gli anticorpi policlonali sono una serie di anticorpi diversi che colpiscono molti epitopi sullo stesso antigene o proteina per la quale un anticorpo ha specificità. Gli anticorpi monoclonali che riconoscono un epitopo lineare sono preferiti in quanto ciò garantisce che l'epitopo possa essere trovato su una proteina denaturata o linearizzata. Questo è importante perché molti anticorpi riconoscono solo epitopi conformazionali, il che significa che riconoscono le proteine solo nel loro stato 3D nativo.

Oltre ai frammenti Fab, gli anticorpi contengono una regione Fc, che è specifica per l'animale che ha prodotto l'anticorpo. Nell'immunoblotting, questa regione è utilizzata principalmente come epitopo per un anticorpo secondario – un anticorpo che riconosce il primo anticorpo che si è legato alla proteina che si sta cercando di rilevare.

Al fine di produrre un segnale osservabile, gli anticorpi sono spesso collegati, attraverso la loro regione Fc, a un enzima reporter, come la fosfatasi alcalina o la perossidasi di rafano. Questi enzimi reporter producono segnali reagendo con i substrati per causare cambiamenti di colore o produrre cambiamenti di luce.

Questi cambiamenti possono quindi essere quantificati utilizzando la densitometria. La densitometria è la tecnica utilizzata per misurare la densità di una banda proteica utilizzando un software di analisi delle immagini per calcolare la densità di ciascuna banda. Le bande possono quindi essere quantificate direttamente utilizzando standard di riferimento o controllate internamente utilizzando un campione di controllo.

Per un trasferimento occidentale di successo, il gel viene prima bilanciato nel tampone di trasferimento per 15 minuti. La membrana deve anche essere bilanciata secondo le istruzioni dei produttori.

Successivamente, il sandwich di trasferimento del gel viene preparato con cura nel buffer di trasferimento per evitare che le bolle rimangano intrappolate all'interno del sistema. Le bolle intrappolate nel sandwich possono essere espulse rotolando su di esse con una piccola pipetta. Anche piccole bolle possono interrompere il trasferimento delle proteine causando un trasferimento incompleto come si può vedere sulle parti inferiori di questa membrana.

Una volta assemblato, il buffer di trasferimento aggiuntivo viene versato nella camera di trasferimento e viene eseguito a 20-30 mA per 2-3 ore. Il tampone di trasferimento contiene metanolo, che migliora il legame delle proteine alla membrana.

Una volta completato il trasferimento, la cassetta viene smontata e la qualità del trasferimento può essere controllata utilizzando una macchia proteica non specifica come Ponceau S. Ciò offre un rilevamento rapido e reversibile delle bande proteiche.

Il primo passo dell'immunoblotting è quello di coprire le restanti aree della membrana con una soluzione diluita di proteine. Questo passaggio è chiamato blocco e viene eseguito, al fine di bloccare la membrana e ridurre il legame non specifico dell'anticorpo alla membrana. Tipicamente, la soluzione bloccante è costituita da albumina sierica bovina o latte secco non grasso disciolto in una soluzione salina tamponata. Questo passaggio viene solitamente eseguito per 1 ora durante la notte su uno shaker.

Il prossimo passo è incubare la membrana con l'anticorpo primario diluito nella soluzione bloccante. Questo passaggio può richiedere da 30 minuti a una notte e deve essere eseguito con agitazione delicata.

Quindi, la membrana viene accuratamente risciacquata per ridurre la colorazione di fondo non specifica e l'anticorpo secondario viene aggiunto in tampone bloccante alla membrana. Dopo una breve incubazione, la membrana viene nuovamente risciacquata accuratamente.

Gli anticorpi secondari sono rilevabili grazie agli enzimi reporter che sono legati ad essi. Dopo l'aggiunta del substrato corretto, le modifiche colorimetriche o chemiluminescenti possono essere riprese e quindi misurate utilizzando tecniche di densitometria. Inoltre, la scala proteica fornisce un prezioso riferimento di dimensione in modo che la dimensione lineare di ciascuna proteina possa essere stimata in base a quanto è migrata nel gel rispetto ai marcatori di dimensione nella scala. Osservare la dimensione delle proteine rilevate tramite immunoblotting è un buon modo per verificare che l'anticorpo stia riconoscendo la proteina corretta e se si tratti di un monomero o di più copie della proteina che vengono viste.

Esistono migliaia di anticorpi primari disponibili in commercio, che consentono il rilevamento e la quantificazione di proteine specifiche all'interno di un campione. Qui un ricercatore utilizza un anticorpo per HIF-1α per misurare la quantità di questo fattore di trascrizione sensibile all'ossigeno in colture cellulari per lo screening dell'ipossia. Hanno anche usato un anticorpo per la beta-actina per agire come controllo del carico. Come si può vedere, le cellule coltivate in condizioni normali di ossigeno hanno prodotto molto meno HIF-1 rispetto a quelle coltivate in condizioni di basso contenuto di ossigeno.

La combinazione di elettroforesi su gel 2D e immunoblotting può fornire preziose informazioni sulla presenza di complessi proteici. Qui, i campioni sono stati prima eseguiti per dimensione del complesso proteico e poi denaturati in modo che ogni singola proteina del complesso potesse essere separata dalla loro dimensione individuale. Gli anticorpi per tre diverse proteine mostrano tre complessi unici contenenti un numero diverso di queste proteine con ogni complesso disposto in una linea verticale. La colonna più a sinistra contiene beta-2 e MCP-21, così come un'altra proteina non mostrata da questi marcatori. La colonna centrale mostra un complesso che conteneva tutte e 3 le proteine, e la colonna di destra conteneva solo beta-2 e MCP-21.

L'immunoblotting può anche essere usato per visualizzare le interazioni proteina-proteina. Questo viene eseguito trasferendo prima le proteine da un gel su una membrana di nitrocellulosa e quindi sondando quella membrana con proteine aggiuntive. L'immunoblotting viene quindi utilizzato per rilevare se le proteine aggiunte si sono complessate con una qualsiasi delle proteine che sono state immobilizzate sulla membrana.

Hai appena visto il video di JoVE sull'immunoblotting. Ora dovresti capire come trasferire le proteine a una membrana, sondare la membrana con anticorpi e rilevare il segnale. Come sempre, grazie per aver guardato!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter