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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Overview

웨스턴 블로팅은 전기전구분리 시료에서 특정 단백질의 존재를 식별하는 데 사용됩니다. 나트륨 도데딜 황산염 폴리아크라이글라미드 젤 전기포고증 또는 SDS-PAGE로 알려진 기술에 의한 분리에 따라, 서부 전달은 폴리아크릴아미드 젤에서 단백질을 각 위치에서 단백질을 트랩하는 막 조각으로 이동시키는 데 사용된다. 다음으로, 막은 면역제팅에게 불린 프로세스에 있는 항체로 조사됩니다. 면역블로팅은 특정 인식 부위를 통해 항체 단백질 및 항체 결합을 사용하며 단일 단백질을 식별하는 데 필요한 높은 특이성을 제공합니다. 항체의 검출은 효소의 사용을 포함하는 기자 시스템을 사용하여 일어난다. 효소는 항체의 끝에 부착하고 색상이나 빛의 변화를 생성하기 위해 기판과 반응할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 신호는 밀도라는 프로세스를 사용하여 이미지를 만들고 정량화할 수 있습니다.

이 비디오 기사는 서부 전세, 항체 검출 의 사용 및 이미지 분석을 설명하여 서양 얼룩 기술에 대한 개요를 제시합니다. 이송 샌드위치 및 이송 조건의 조립과 같은 서부 전달과 관련된 단계는 항체 결합 및 항체의 검출 뒤에 대한 이론뿐만 아니라 자세히 논의된다. 이 기술의 광범위한 응용 프로그램은 단백질 -단백질 상호 작용의 검출및 단백질 복합체 내의 개별 단백질의 식별을 포함하여 몇몇 예를 통해 기술됩니다.

Procedure

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웨스턴 블로팅은 항체를 사용하여 전기 전구 분리 된 샘플에서 특정 단백질의 존재를 확인하기 위해 많은 연구자들이 사용하는 강력한 기술입니다.

이 기술의 3가지 주요 단계는 품질 결과에 필수적인 3가지 주요 단계인 전기연전, 면역블로팅 및 검출입니다. 이러한 단계를 시도하기 전에, 변성 단백질이 폴리 아크릴아미드 젤의 크기로 분리되는 SDS-PAGE는 수행해야합니다.

전기 벌팅은 서양 "이송"이라고도 하며 아크릴리제 젤에서 얇은 막으로 단백질을 전송하는 장치뿐만 아니라 "샌드위치"를 함께 보유하기 위한 전달 카세트가 필요합니다. 전기 연팅 샌드위치는 두 개의 필터 용지 사이에 끼어있는 젤과 특수 멤브레인으로 구성됩니다. 전이 도중, 전기장은 겔을 통해 단백질을 이동하기 위하여 이용되고, 그(것)들은 충전되고 소수성 상호 작용 때문에 막에 갇혀 됩니다.

면역 블로팅은 특정 단백질을 위해 막을 "프로브"하기 위해 항체를 사용합니다. 항체는 다른 단백질에 결합하는 Fab 지구로 도알려져 있는 2개의 단편을 포함하는 큰 Y 자형 단백질입니다. Fab 영역은 항체가 결합할 단백질의 특정 에피토프 또는 특정 부분을 정의합니다.

단일 클론 항체는 단일 에피토프를 인식하는 항체이며 특이성으로 인해 면역 블로팅에 사용되는 바람직한 항체 유형이다. 대조적으로, 다환 항체는 항체가 특이성을 가지고 있는 단백질 - 또는 동일한 항원에 많은 전형체를 표적으로 하는 다른 항체의 시리즈입니다. 선형 에피토프를 인식하는 단일 클론 항체는 에피토프가 변성 또는 선형화 된 단백질에서 발견 될 수 있도록하는 것으로 선호됩니다. 이것은 많은 항체가 그들의 네이티브 3D 상태에서 단백질을 인식하는 것을 의미하는 형성 전형만 인식하기 때문에 중요합니다.

팹 단편 이외에, 항체는 항체를 생성한 동물에 특정한 Fc 영역을 포함합니다. 면역 블로팅에서, 이 지역은 주로 이차 항체를 위한 에피토프로 이용됩니다 - 검출하려는 단백질에 묶여 있는 첫번째 항체를 인식하는 항체.

관찰 가능한 신호를 생산하기 위해 항체는 종종 Fc 영역을 통해 알칼리인스파타제 또는 고추냉이 과산화와 같은 기자 효소와 연결됩니다. 이러한 리포터 효소는 기판에 반응하여 색상을 변경하거나 빛의 변화를 일으키도록 신호를 생성합니다.

그런 다음 이러한 변경 사항은 밀도를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 밀도는 각 대역의 밀도를 계산하기 위해 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 단백질 대역의 밀도를 측정하는 데 사용되는 기술이다. 그런 다음 대역은 참조 표준을 사용하여 직접 정량화하거나 제어 샘플을 사용하여 내부적으로 제어할 수 있습니다.

성공적인 서양 전달을 위해 젤은 먼저 15 분 동안 전송 버퍼로 평형됩니다. 멤브레인은 또한 제조 지침에 따라 평형화되어야합니다.

다음으로, 젤 이송 샌드위치는 거품이 시스템 내에 갇히는 것을 방지하기 위해 이송 버퍼에서 신중하게 준비됩니다. 샌드위치에 갇힌 거품은 작은 파이펫으로 굴려 강제로 꺼낼 수 있습니다. 작은 거품조차도 이 막의 하부에서 볼 수 있듯이 불완전한 전이를 일으키는 단백질의 전달을 방해할 수 있습니다.

조립되면 추가 이송 버퍼가 전송 챔버에 부어 20-30 mA에서 2-3 시간 동안 실행됩니다. 전달 버퍼에는 막에 단백질의 결합을 향상시키는 메탄올이 포함되어 있습니다.

이송이 완료되면 카세트가 분해되고 Ponceau S와 같은 비특이적 단백질 얼룩을 사용하여 전달의 품질을 확인할 수 있습니다. 이것은 단백질 밴드의 빠르고 가역적인 검출을 제공합니다.

면역 블로팅의 첫 번째 단계는 단백질의 희석 용액으로 막의 나머지 영역을 커버하는 것입니다. 이 단계는 차단이라고 하며, 멤브레인을 차단하고 항체의 비특이적 결합을 막에 감소시키기 위해 수행된다. 일반적으로 차단 용액은 완충식염액에 용해된 소 혈청 알부민 또는 비지방 건조 우유로 구성된다. 이 단계는 일반적으로 셰이커에서 1 시간에서 하룻밤 사이에 수행됩니다.

다음 단계는 차단 용액에서 희석된 1차 항체로 멤브레인을 배양하는 것이다. 이 단계는 30 분에서 하룻밤까지 걸릴 수 있으며 부드러운 동요로 수행해야합니다.

이어서, 멤브레인은 비특이적 배경 염색을 감소시키기 위해 철저하게 헹구고 이차 항체가 멤브레인에 버퍼를 차단하는 데 첨가된다. 짧은 잠복 후 멤브레인이 다시 완전히 헹됩니다.

이차 항체는 그(것)들에 묶여 있는 기자 효소 덕분에 검출할 수 있습니다. 올바른 기판을 추가하면 색소 또는 화학 발광 변화를 분석한 다음 밀도 측정 기술을 사용하여 측정할 수 있습니다. 또한, 단백질 사다리는 각 단백질의 선형 크기가 사다리의 크기 마커에 비해 겔에서 얼마나 멀리 이동했는지에 따라 추정될 수 있도록 귀중한 크기 기준을 제공한다. 면역 blotting을 통해 검출된 단백질의 크기를 관찰하는 것은 항체가 올바른 단백질을 인식하고 있는지, 그리고 그것이 보이는 단백질의 단량체 또는 다중 사본인지 확인하는 좋은 방법입니다.

시료 내에서 특정 단백질의 검출 및 정량화를 허용하는 수천 개의 시판 가능한 1 차 항체가 있습니다. 여기서 연구원은 HIF-1α를 위한 항체를 사용하여 저산소증을 위해 스크린하는 세포 배양에서 이 산소 반응성 전사 인자의 양을 측정합니다. 그(것)들은 또한 로딩 통제로 작동하기 위하여 베타 액틴을 위한 항체를 이용했습니다. 당신이 볼 수 있듯이, 정상적인 산소 조건에서 배양 된 세포는 낮은 산소 조건에서 배양 된 세포보다 훨씬 적은 HIF-1을 생산.

2D 겔 전기 포와 면역 블로팅의 조합은 단백질 복합체의 존재에 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다. 여기서, 견본은 단백질 복합 크기에 의해 첫째로 실행되고, 그 후 복합체에 있는 각 개별 단백질은 그들의 개별적인 크기에 의해 분리될 수 있었다 그래야 변성되었습니다. 3개의 다른 단백질을 위한 항체는 수직 선에 배열된 각 복합체를 가진 이 단백질의 다른 수를 포함하는 3개의 유일한 복합체를 보여줍니다. 왼쪽 대부분의 컬럼에는 베타-2 및 MCP-21뿐만 아니라 이러한 마커에 의해 표시되지 않은 다른 단백질이 포함되어 있습니다. 중앙 기둥은 모든 3 단백질을 포함하는 복합체를 보여주고, 오른쪽 컬럼은 베타-2 및 MCP-21만 포함했다.

면역 블로팅은 단백질 단백질 상호 작용을 시각화하는 데도 사용할 수 있습니다. 이것은 먼저 니트로 셀룰로오스 막에 젤에서 단백질을 전송하고 추가 단백질로 그 막을 탐구해서 수행됩니다. 면역 블로팅은 그 때 추가된 단백질이 막에 고정된 단백질로 복합되는 경우에 검출하기 위하여 이용됩니다.

당신은 면역 blotting에 JoVE의 비디오를 보았다. 이제 단백질을 막으로 옮기고, 항체로 막을 탐사하고, 신호를 감지하는 방법을 이해해야 합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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