La supplementazione alimentare di acidi grassi polinsaturi a Caenorhabditis elegans

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare mezzi dietetici per alterare la composizione degli acidi grassi di sea elegance al fine di studiare la funzione e la regolazione degli acidi grassi. Ciò si ottiene coltivando la fonte di cibo del nematode in presenza di acidi grassi insaturi. Successivamente l'eleganza del mare viene nutrita con i batteri integrati che consentono l'assorbimento dell'acido grasso e la sua incorporazione nel verme.

I lipidi cambiano poi in eleganza marina. La composizione degli acidi grassi è confermata dall'analisi di spettrometria di massa gascromatografica. Infine, dopo essersi nutriti di acidi grassi insaturi, i vermi vengono valutati per la sterilità.

Si ottengono risultati che mostrano gli effetti fisiologici di un'alterata composizione degli acidi grassi attraverso il comportamento di sviluppo e i cambiamenti nell'espressione genica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'eleganza, dello sviluppo e della fisiologia del mare, perché possiamo utilizzare sia la manipolazione genetica che i contributi dietetici per alterare la composizione degli acidi grassi e monitorarne le conseguenze. In generale, le persone che si avvicinano per la prima volta a questo metodo devono essere attente e caute perché è difficile ottenere risultati coerenti a causa della sensibilità degli acidi grassi insaturi all'ossigeno e alle alte temperature.

Per preparare un litro di terreno integrato con acidi grassi, misurare i seguenti componenti in un pallone. Aggiungere acqua millipore fino a 800 millilitri e sterilizzare in autoclave il terreno insieme a una bottiglia di vetro vuota per ogni concentrazione di acidi grassi da testare, nonché ad opportuni cilindri graduati mentre il terreno si raffredda a 55 gradi Celsius. Preparare la soluzione madre di lavoro del sale sodico dell'acido grasso aprendo con cura la fiala di vetro in modo da non far entrare particelle di vetro nella polvere e pesando abbastanza per ottenere una soluzione madre da 100 millimolari, aggiungere la quantità necessaria di acqua purificata.

Successivamente, utilizzando argon o azoto gassoso, spurgare la soluzione per prevenire l'ossidazione degli acidi grassi. Quindi tappare la fiala e conservare la fiala al buio mentre l'acido grasso, il sale di sodio, si sta dissolvendo. Quando l'agri si è raffreddato a 55 gradi Celsius al successivo, quindi vicino a una fiamma, trasferire la soluzione in un cilindro graduato sterile.

Prima di aggiungere acqua sterile fino a un litro, trasferire nuovamente il terreno nel pallone e continuare a mescolare. Utilizzare un cilindro graduato sterile per trasferire un'aliquota di terreno in un flacone autoclavato per ogni concentrazione di acidi grassi da testare. Tenendo poi le bottiglie in caldo su una piastra per mescolare.

Mescolare la concentrazione appropriata di soluzione madre di acidi grassi prima di utilizzare una pipetta sterile da 25 millilitri per versare le piastre dopo che le piastre si sono solidificate, coprire e conservarla a temperatura ambiente in un'area ben controllata al buio. Due giorni dopo, utilizzare e coli OP 50 per seminare le piastre, quindi incubare le piastre in un ambiente buio a temperatura ambiente mentre il prato batterico si sta asciugando. Preparare una popolazione sincronizzata di larve di L uno trattando Ravi Hermafrodites con una soluzione alcalina di ipoclorito.

Cullare delicatamente gli ermafroditi GR in questa soluzione fino a quando i vermi adulti non si dissolvono. Quindi centrifugare a bassa velocità per pellettare le uova. Usa il tampone M nine per lavare le uova tre volte.

Quindi, in un tubo da 15 millilitri, risospenderli in cinque millilitri di tampone M nove e farli oscillare per una notte. Aggiungere le larve L one alle piastre con semi OP 50 che sono state integrate con 0,3 millimolari di acido homo gammalin o DGLA e incubarle a 20 gradi Celsius per tre giorni o fino a quando le larve non raggiungono lo stadio adulto. Usa un microscopio da dissezione per valutare la sterilità dei vermi adulti.

La perdita di germi di successo apparirà come un utero chiaro privo di ovuli. In alternativa, segna i vermi raccogliendoli in una goccia di M nove buffer su un vetro dell'orologio. Quindi utilizzare un millilitro di 0,2 nanogrammi per millilitro di soluzione dappy per inondare il vetro dell'orologio e incubare per circa cinque minuti.

Dopo l'incubazione, raccogliere i vermi in una goccia di terreno di montaggio su un vetrino prima di coprirli con un vetrino coprioggetti, sigillare il vetrino coprioggetto e conservarlo a quattro gradi Celsius al buio durante la notte o osservarlo immediatamente al microscopio a fluorescenza per produrre esteri metilici di acidi grassi o fame. Per quantificare l'assorbimento degli acidi grassi, raccogliere da 500 a 1000 vermi adulti usando l'acqua per lavarli via dalle piastre e trasferirli in siliconati. Tubi superiori a vite in vetro da 13 x 100 millimetri.

Lascia che i vermi si depositino per gravità e poi usa una pipetta di vetro per rimuovere quanta più acqua possibile. Aggiungere un millilitro di acido solforico al 2,5% in metanolo e scaldare i tubi a bagnomaria a 70 gradi Celsius per un'ora dopo essersi raffreddati per un minuto sotto la cappa, estrarre i telai aggiungendo 1,5 millilitri di acqua e 0,25 millilitri di esano. Richiudere i tubi e agitare energicamente.

Quindi centrifugare le provette in una centrifuga clinica da tavolo per un minuto per separare l'esano dal solvente acquoso. Trasferire lo strato superiore di esano in una gascromatografia o in un foglietto di GC all'interno di un flaconcino di GC. Per l'analisi mediante gc, iniettare da uno a due microlitri di fame su una colonna di gascromatografia capillare polare adatta per l'analisi del fame.

Impostare l'iniettore a 250 gradi Celsius con una portata di 1,4 millilitri al minuto. Programmare il forno per una temperatura iniziale di 130 gradi Celsius mantenuta per un minuto. Quindi aumentare la temperatura di 10 gradi Celsius al minuto fino a raggiungere i 190 gradi Celsius, quindi aumentarla di nuovo a cinque gradi Celsius al minuto fino a 210 gradi Celsius, quindi tenere premuto per un altro minuto per assicurarsi che si sia verificata l'adozione di DGLA.

Analizza i frame mediante rilevamento a ionizzazione di fiamma o spettrometria di massa o rilevamento MS utilizzando standard autentici per l'identificazione dell'eleganza del mare. L'integrazione di acidi grassi della dieta sea elegance è limitata dalla capacità della fonte alimentare batterica di assorbire e incorporare gli acidi grassi nella membrana batterica per determinare la capacità di e coli OP 50 di assimilare vari acidi grassi nelle sue membrane. OP 50 è stato placcato su terreni senza supplementi, concentrazioni di 0,1 millimolari e 0,3 millimolari di acido sterico, ato di sodio e DGLA di sodio, come mostrato in questa figura L'analisi della fama di GCMS dimostra che gli acidi grassi insaturi, tra cui OLEATO e DGLA, si incorporano in OP 50 a livelli più elevati rispetto all'acido sterico degli acidi grassi saturi.

Inoltre, la misurazione delle quantità di acidi grassi nei vermi allo stadio adulto rivela che l'integrazione con acidi grassi saturi non ha alcun effetto sulla quantità relativa di acidi grassi saturi nei tessuti dei vermi. Tuttavia, l'integrazione con acidi grassi insaturi ha aumentato le quantità relative di questi grassi presi insieme. Questi dati indicano che l'accumulo relativo di acidi grassi integrati nella dieta è direttamente correlato con l'accumulo relativo di acidi grassi nella dieta e coli.

Come abbiamo dimostrato in precedenza, questo grafico illustra la dose-risposta dell'induzione della sterilità da parte della DGLA nell'eleganza del mare. La concentrazione di DGLA nei lipidi dei vermi in cui il 50% della popolazione sarà sterile è di circa il 12% E, cosa interessante, la risposta al DGLA può essere alterata da mutazioni genetiche nei vermi. Sulla base di una recente scoperta che le vie di stress dipendenti dal fattore di crescita dell'insulina possono influenzare la distruzione delle cellule germinali indotta da DGLA.

Abbiamo integrato la dieta di vermi contenenti mutazioni deleterie nel recettore IGF dell'insulina DAF 2 o nel fattore di trascrizione FOXO DAF 16 Con DGLA, un punteggio di sterilità in ciascun ceppo ha mostrato che i mutanti DAF due erano fertili con poca o nessuna perdita di cellule germinali indotta rispetto ai vermi wild type a entrambe le concentrazioni di DGLA. Al contrario, i vermi integrati con vox O inattivo hanno mostrato una percentuale più elevata di vermi sterili rispetto al tipo selvatico quando alimentati su piastre contenenti 0,15 millimolari di acido grasso. Seguendo questa procedura, i ricercatori possono eseguire numerosi saggi con l'eleganza marina integrata, come studi di espressione genica, saggi comportamentali o analisi dello sviluppo o della riproduzione.

Questi saggi riveleranno il ruolo di specifici acidi grassi in questi processi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare costantemente terreni integrati con acidi grassi che possono essere utilizzati per alterare la composizione degli acidi grassi dell'eleganza del mare.