Overview
L'interferenza dell'RNA (RNAi) è una tecnica ampiamente utilizzata in cui l'RNA a doppio filamento viene introdotto esogenamente in un organismo, causando l'abbattimento di un gene bersaglio. Nel nematode, C. elegans, l'RNAi è particolarmente facile ed efficace perché può essere erogato semplicemente alimentando i batteri vermi che esprimono RNA a doppio filamento (dsRNA) che è complementare a un gene di interesse. In primo luogo, questo video introdurrà il concetto di interferenza dell'RNA e spiegherà come provoca l'abbattimento mirato del gene. Quindi, dimostreremo un protocollo per l'uso di RNAi in C. elegans, che include la preparazione dei batteri e delle piastre di vermi RNAi, la coltura dei vermi e come valutare gli effetti dell'RNAi sui vermi. L'RNAi viene spesso utilizzato per eseguire screening genetici inversi al fine di rivelare quali geni sono importanti per svolgere specifici processi biologici. Inoltre, gli screening genetici inversi automatizzati consentono l'abbattimento e l'analisi efficienti di una vasta collezione di geni. Infine, RNAi è spesso usato per studiare lo sviluppo di C. elegans. Dalla sua scoperta, gli scienziati hanno usato l'RNAi per fare enormi progressi nella comprensione di molti fenomeni biologici.
Procedure
L'interferenza dell'RNA, o RNAi, è una tecnica ampiamente utilizzata in cui l'RNA a doppio filamento viene introdotto in un organismo, con conseguente silenziamento genico mirato. La scoperta vincitrice del Nobel dell'interferenza dell'RNA ha permesso ai ricercatori di silenziare qualsiasi gene C. elegans per determinarne la funzione. Possiamo indurre RNAi in C. elegans preparando prima piastre con E. coli che esprimono il gene bersaglio dsRNA, che i vermi mangeranno. Quindi, i vermi del 4 ° stadio larvale vengono trasferiti alle piastre RNAi e autorizzati a depostare le uova. Nella fase desiderata di sviluppo la progenie viene raccolta e valutata per fenotipi.
La tecnologia RNAi è spesso utilizzata in C. elegans per condurre screening genetici inversi, schermi automatizzati ad alto rendimento e come strumento per studiare i processi di sviluppo. In questo video, spiegheremo il concetto di interferenza dell'RNA, dimostreremo come utilizzare la tecnica RNAi in C. elegans e discuteremo di come gli scienziati stanno usando l'RNAi come strumento per comprendere meglio i processi biologici diffusi.
Iniziamo mostrandoti prima come funziona l'interferenza dell'RNA. Nel caso di C. elegans, i vermi sono nutriti con batteri, che sono stati trasformati con plasmidi che codificano per RNA a doppio filamento complementare al gene che si desidera silenziare. Come accennato in precedenza, C. elegans si nutrirà dei batteri trasformati. Attraverso un meccanismo attualmente sconosciuto, il dsRNA entra nel tessuto C. elegans una volta ingerito.
Una volta all'interno della cellula, l'enzima Dicer scinde l'RNA a doppio filamento in RNA interferente corto, o siRNA, che è lungo tra 21 e 23 nucleotidi. Successivamente, il siRNA si associa al complesso di silenziamento indotto dall'RNA, noto anche come "RISC", e viene srotolato. Quindi, il complesso siRNA/RISC lega l'mRNA bersaglio tramite accoppiamento di basi complementari. Questo porta alla degradazione dell'mRNA, abbattendo così quel gene.
Prima di iniziare la procedura, i batteri che esprimono l'RNA a doppio filamento di interesse devono essere preparati. Librerie di batteri che contengono plasmidi codificanti dsRNA per migliaia di geni sono disponibili in commercio. Altrimenti, la sequenza del gene bersaglio deve essere clonata in un plasmide utilizzando tecniche di clonazione standard. Il plasmide contiene un gene per la resistenza all'antibiotico ampicillina, che può essere utilizzato per selezionare le colonie batteriche che contengono il plasmide.
Successivamente, utilizzare tecniche standard per trasformare il plasmide che codifica il dsRNA di interesse nel ceppo (DE3) di batteri E. coli che esprimeranno l'RNA a doppio filamento. Inoltre, trasformare i batteri con un plasmide vuoto come controllo. È importante sottolineare che il ceppo di E. coli utilizzato in questi esperimenti manca di RNA polimerasi III, che altrimenti digerirebbe l'RNA a doppio filamento. Questo batterio contiene anche un gene inducibile IPTG per la DNA polimerasi T7, che trascrive il dsRNA nel plasmide. Infine, i batteri (DE3) sono resistenti sia alla tetraciclina che alla carbenicillina, per mantenere l'espressione della RNA polimerasi III e prevenire la crescita batterica indesiderata.
Distribuire i batteri trasformati HT115 (DE3) su piastre di agar LB contenenti tetraciclina da 12,5 μg / ml e 25 μg / ml di carbenicillina. Incubare durante la notte a 37 °C e la mattina successiva saranno presenti colonie batteriche sulle piastre. Quindi, selezionare una singola colonia di batteri e aggiungerla a 1 ml di brodo LB contenente 100 μg / ml di ampicillina per selezionare i batteri contenenti il plasmide. Incubare durante la notte a 37 °C con agitazione. Dopo l'incubazione notturna, aggiungere 5 ml di brodo LB contenente 100 μg/ml di ampicillina alla coltura e incubare per altre 4-6 ore a 37 °C.
Una volta che i batteri sono pronti, le piastre dei vermi RNAi devono essere preparate per l'alimentazione. Le piastre di vermi RNAi contengono: agar, acqua, carbenicillina, miscela media di vermi e IPTG per indurre la DNA polimerasi T7 nei batteri che trascrivono il dsRNA nel plasmide. Aggiungere 0,5 ml di coltura batterica alle piastre di vermi RNAi e incubare durante la notte a 37 °C, creando un prato batterico.
Prima di aggiungere vermi alle placche RNAi, è importante sincronizzare lo stadio di sviluppo del verme, in modo che eventuali differenze osservate nel fenotipo non siano un artefatto dello stadio di sviluppo. Al fine di sincronizzare le fasi di sviluppo, prima sterilizzare a fiamma un plettro di filo di platino.
Utilizzare il worm pick per aggiungere vermi L4 a ciascuna piastra RNAi e incubare durante la notte a 20 ° C, consentendo loro di diventare giovani adulti che depongono le uova. Quindi, trasferire i giovani adulti nella nuova piastra RNAi e incubare per 6-8 ore a 20 ° C, durante le quali vengono deposte le uova. Una volta rimossi tutti gli adulti, queste uova saranno sincronizzate in modo dello sviluppo. Infine, consentire ai vermi di crescere su piastre RNAi fino a quando non hanno raggiunto la fase di sviluppo di interesse per l'analisi.
Per visualizzare i vermi, è necessario preparare una diapositiva con un tampone di agar al 4%. In primo luogo, nastro 2 vetrini con nastro adesivo, creando distanziali che garantiscono uno spessore uniforme del tampone di agar. Posizionare una slitta di vetro pulita tra i due distanziali e un pipetto di circa 150 μl di agar fuso al 4% sul vetrino. Coprire rapidamente l'agar fuso con un ulteriore vetrino perpendicolare ai distanziali. Separare delicatamente le diapositive e il tampone di agar sarà aderito a una delle diapositive.
Quindi, aggiungere 10 μl di un anestetico come l'azide di sodio al tampone di agar per immobilizzare gli animali. Utilizzando un plettro in filo di platino, trasferire i vermi al tampone di agar con anestetico e aggiungere uno slip di copertura. Infine, osserva i vermi al microscopio. Confronta i vermi che hanno avuto l'abbattimento del gene RNAi con i controlli e nota le differenze di dimensioni, stadio di sviluppo, morfologia, modelli di localizzazione di proteine marcate fluorescentemente e altri potenziali fenotipi.
Una delle applicazioni più preziose dell'interferenza dell'RNA è la capacità di eseguire facilmente screening genetici inversi. Uno screening genetico inverso è un approccio per scoprire la funzione genica abbattendo una raccolta nota di geni e valutando il risultato fenotipico. Ad esempio, i ricercatori possono utilizzare una libreria di batteri che esprimono dsRNA per quasi tutti i geni nel genoma di C. elegans. Questi batteri vengono coltivati su piastre multi-pozzo e alimentati ai vermi. Quindi, gli effetti fenotipici dell'abbattimento dell'RNAi di molti geni possono essere valutati, fornendo informazioni sulle normali funzioni geniche in vivo.
Gli screening genetici automatizzati sono un tipo di schermo genetico inverso che ha un rendimento estremamente elevato. Negli screening genetici automatizzati, l'intero genoma di C. elegans può essere abbattuto molto facilmente utilizzando la gestione robotica delle migliaia di cloni batterici e utilizzando strumenti specializzati per l'analisi quantitativa.
Ad esempio, i vermi che esprimono un reporter fluorescente transgenico per il gene peptidico antimicrobico nlp 29, sono soggetti all'abbattimento RNAi di migliaia di geni tramite alimentazione batterica. Allo stesso tempo, i vermi vengono introdotti nelle spore fungine. Quindi, è possibile valutare la risposta peptidica antimicrobica al fungo.
Lo sviluppo di C. elegans è spesso studiato utilizzando RNAi. Gli scienziati possono utilizzare l'interferenza dell'RNA per abbattere qualsiasi gene (o raccolta di geni) di interesse e valutare esattamente come quel gene influisce sui processi durante lo sviluppo e / o i tempi di sviluppo. Ad esempio, l'abbattimento dell'RNAi può rivelare geni che ritardano lo sviluppo quando abbattuti o geni coinvolti nello sviluppo degli organi.
Hai appena visto l'introduzione di JOVE all'interferenza dell'RNA in C. elegans. Abbiamo esaminato come funziona l'interferenza dell'RNA e come utilizzare l'interferenza dell'RNA in C. elegans tramite alimentazione batterica. L'interferenza dell'RNA è uno strumento prezioso per gli schermi genetici inversi, compresi gli schermi automatizzati ad alto rendimento, ed è anche uno strumento utile per studiare lo sviluppo. Grazie per l'attenzione!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
