インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

この手順の全体的な目標は、タンパク質固定化の一般的な足場として使用できる、非常に安定したタンパク質ハイドロゲルを合成することです。これは、まず細菌宿主で2つのタンパク質ハイドロゲルビルディングブロックを合成することによって達成されます。各ビルディングブロックには、架橋剤として機能するキメラタンパク質のサブユニットと、NPUスプリットエンの半分が含まれています。

次に、これらのタンパク質を第2ステップのアフィニティークロマトグラフィーで精製します。精製されたタンパク質ビルディングブロックは、ハイドロゲル形成を誘発する架橋剤に隣接する自己組織化ポリペプチドを構成する10代のトランススプライシング反応で開始して混合されます。このハイドロゲルは、適切な結合モチーフをタンパク質ブロックに溶液で取り込むことで非常に安定です。

共重合体は、機能的な眼球タンパク質をハイドロゲルビルディングブロックに部位特異的に便利に組み込むことを可能にし、その結果、ヒドロゲルが形成され、固定化された眼球タンパク質は室温で3週間にわたって低い浸出速度を示します。最後に、このタンパク質ハイドロゲルに固定化された酵素は、有機溶媒による変性から保護されます。したがって、このヒドロゲルは、有機合成のためのバイオリアクターとしても機能します。

この技術の主な利点は、安定したタンパク質固定化のための既存の方法よりも、それらを含む、架橋表面LIを含むもの、または多孔質支持体またはインター酵素架橋における酵素の固体足場カプセル化で歌うものよりも、タンパク質側鎖の化学修飾なしに、多孔質および高度に水和した環境で標的タンパク質を安定して固定化する能力である。また、この技術は、経路内の複数の酵素を所定の三次元配置で組み立てることを可能にし、酵素間の基質チャネリングを促進することができます。この手順を開始する前に、組換えDNA技術によるプラスミド構築を介して2つのタンパク質ブロック共重合体NおよびCを生成し、続いてタンパク質発現およびREIA coli B 21 de threeを使用して、湿ったペレットのグラムあたり10ミリリットルで緩衝A中の細胞ペレットを精製および再懸濁します。

次に、ペレット懸濁液を氷水浴に浸し、10アンペアで1秒のパルスと終了したら6秒間の一時停止で超音波処理することにより細胞を破壊します。ライセートをGの6, 000倍で摂氏4度で20分間遠心分離します。遠心分離機からチューブを取り出した後、S上清を廃棄し、以前と同じ条件で遠心分離後にペレットを緩衝DAに再懸濁し、上清を低圧クロマトグラフィーシステムを使用して緩衝DAで平衡化した5ミリリットルのNTAカラムに通過させます。

次いで、カラムを45ミリモルのオール溶出液を添加した30ミリリットルの緩衝液DAで洗浄し、精製したタンパク質を150ミリモルのオールを添加した20ミリリットルの緩衝液DAを用いて洗浄する。精製したタンパク質を、30キロダルトンの限外ろ過スピンカラムが入った遠心分離チューブに移します。容量が1ミリリットル未満になるまで、Gの2,800倍と摂氏4度でサンプルを遠心分離します。

終了したら、14 mLのDPBSバッファーをカラムに加えて、タンパク質サンプルを希釈します。バッファー交換後、遠心分離と希釈のステップをさらに3回繰り返し、精製したタンパク質にDTTを添加して、最終濃度を2ミリモルにします。次に、タンパク質を30キロダルトン限外ろ過スピンカラムを用いて、摂氏4度でGの2,800倍で約45分〜1時間遠心分離することにより、タンパク質を1ミリリットルあたり約100ミリグラムに濃縮する。

100マイクロリットルのヒドロゲル混合物を作るために、Cの100ミリグラムあたり1ミリグラムのストック溶液の42マイクロリットルと5%アジ化ナトリウムの10マイクロリットル、100ミリモルDTTの5マイクロリットル、および2ミリリットルのガラスバイアルの N.In の100ミリグラムあたり1ミリリットルのストック溶液の42マイクロリットル、バイアルにDPBS緩衝液の1マイクロリットルを添加して、100マイクロリットルの最終容量を達成し、すべての成分を手動で混合します。ピペットチップを使用した旋回運動。遠心融合後、混合物を 8, 000 倍 G で 2 分間インキュベートし、室温で一晩インキュベートして、ENE トランススプライシング反応を完了させます。これに続いて、チューブを逆さまにして50マイクロリットルの1.2ミリモルGFP官能化ヒドロゲルを作ることにより、ヒドロゲルの形成を確認します。

100ミリグラム/ミリリットルのCSH含有溶液から17マイクロリットル、3リガンド、230ミリグラム/ミリグラムのSH 3G FP溶液9マイクロリットルを1対1のモル比で1.7ミリリットルの遠心チューブに混合し、室温で30分間インキュベートします。次に、5マイクロリットルの5%アジ化ナトリウム、2.5マイクロリットルの100ミリモルDTT、および0.5マイクロリットルのDPBSを同じチューブに追加します。次に、16マイクロリットルのNを添加して、NとCSHの3つのリガンドの1対1のモル比を達成し、ピペットチップを使用して渦巻き運動でサンプルを混合し、混合物を8,000倍Gで2分間遠心分離します。

終了したら、混合物を室温で一晩暗所でインキュベートし、ハイドロゲルを形成し、SH 3G FPをカプセル化します。追加のアプリケーションについては、DPBSでホースラディッシュペルオキシダーゼHRPの0.63ミリモル原液溶液を調製して、30マイクロリットルの1.6ミリモルヒドロゲルを作成し、トラッピングHRPは、Cの100ミリグラム/ミリグラムの原液12マイクロリットルと2マイクロリットルのHRPと2マイクロリットルのHRP、3マイクロリットルの5%アジ化ナトリウム、0.5マイクロリットルの300ミリモルDTTおよび1.7ミリリットルの遠心分離チューブを組み合わせた。100ミリグラム/ミリリットルのN溶液と0.5マイクロリットルのDPBS溶液を12マイクロリットル加え、IPEチップを使用して渦巻き運動で溶液を混合します。遠心分離後、混合物をGの8,000倍で2分間、室温で一晩インキュベートします。

酵素反応のために、5.8ミリモルのNNジメチルPPHフェノールジアミン、5.8ミリモルのフェノールおよび2.9ミリモルのタートブチル過酸化水素をNヘプタンに含有する反応カクテルの1ミリリットルにハイドロゲルを沈め、ピペットチップを使用して手動でゲルを破壊し、ヒドロゲルと溶媒の接触表面積を増加させる。HRP生成物とインデルフェノール型色素を検出するには、異なる時間に溶媒のサンプルを採取し、プレートリーダーで546ナノメートルの光吸収度を測定することで、還元剤の存在下で精製されたNとCを混合し、DTTは3番目のタンパク質であるライゲーション生成物Jを個別に形成します。ヒドロゲルビルディングブロックn NCは、粘性流体として存在し、n NCを混合すると透明な半固体材料が生成され、反転後にガラスバイアルの底に保持され、ハイドロゲルの形成を示します。

このeneを介したタンパク質ハイドロゲルは、高い溶液安定性を示します。DPBSバッファー中で摂氏22度で21日後に架橋されたヒドロゲル足場の損失はほとんどまたはまったくありません。DPBSバッファーに放出されるタンパク質の総量は、ハイドロゲル高密度サイトメトリーからスプライシングされたエンの理論量をわずかに超えるだけであるため、ハイドロゲル形成中のトランススプライシング反応の効率は約80%であることが明らかになりました。

SDS ページゲル分析では、トランススプライシングされた生成物が微量にしかヒドロゲル周囲のバッファーに存在していないことが示されました。架橋されたヒドロゲル足場の侵食による損失が最小限であることを確認できます。ハイドロゲルの周囲のバッファーに存在する主なタンパク質は、スプライシングされたintuneです。

室温で3か月以上水溶液に浸した乱されていないヒドロゲルでは、目に見える侵食の兆候は観察されませんでした。また、このハイドロゲルは摂氏37度で、酸性緩衝液と塩基性緩衝液の両方で非常に安定しています。タンパク質の固定化を促進するために、タンパク質とそのペプチドリガンドを使用して、目的のタンパク質をハイドロゲルの足場にドッキングしました。

我々は、アダプタータンパク質CRKからのSAR相同性3ドメインであるSH 3タンパク質を融合のためのドッキングタンパク質として選択し、目的のタンパク質への融合のためのドッキングステーションペプチドとしてそのリガンドをハイドロゲル足場に取り込むためのペプチドとして選択しました。この相互作用ペアは、分子サイズが比較的小さく、親和性が高い有限性のために選択されました。NS SH 3 配位子を NPUC とカット A の間に挿入して CSH 3 配位子を形成しました。

S SH 3タンパク質は、モデル標的球状タンパク質GFPの末端に融合しました。プロトコールに記載されているプロセスでは、1.2ミリモルのトランススプライシングヒドロゲル骨格ビルディングブロックと1.2ミリモルGFPを含むハイドロゲルが得られます。GFPを含むハイドロゲルは、GFPを欠くハイドロゲルと同様の安定性を示し、21日後に総タンパク質損失が約35%でした。

DPBSバッファーでは、侵食バッファーに存在するタンパク質のほとんどが10代で切断されました。S SH3配位子を含有するハイドロゲルからのSH3G FPの浸出は、3週間後に約30%であり、ここに見られるように、ドッキングステーションペプチドを含有するハイドロゲルがs sh 3配位子を欠くハイドロゲルからの浸出よりも有意に小さい。S SHの3つの配位子は、GFP蛍光の大部分を保持しています。

3週間後、ハイドロゲルはSSHの3つの配位子を欠いていますが、基本的に非蛍光性になります。この研究における固定化GFPの密度は、ヒドロゲルの約33モルパーセントです。複数のドッキングステーションペプチドをハイドロゲルビルディングブロックに組み込むと、より高い固定化密度が達成される可能性があります。

次に、HRP酵素をタンパク質ハイドロゲルに組み込み、有機溶媒中の生体触媒を支える能力を実証しました。酵素活性は、NNジメチルpph、Leneジアミン、およびフェノールとタートブチル過酸化水素との酸化カップリングを経時的にモニタリングすることによって測定されました。仮説は、ハイドロゲルの水和環境が、付着した酵素を有機溶媒の変性効果から保護するというものでした。

有機溶媒を浸漬した後、HRPを含むハイドロゲルを手動で小さなクラスターに破壊し、親水性の疎水性界面面積を増加させました。HRPを組み込んだハイドロゲルは、急速な酸化反応を効果的に触媒し、比色生成物を生じさせました。製品の蓄積は、活性化に酵素がほとんどまたはまったくないことを示す線形の傾きに従います。

実験中、HRPは最初にA-D-P-B-Sを溶解し、続いて有機溶媒に添加し、変換を触媒することができましたが、反応速度は大幅に低下しました。DPBSに溶解する酵素の変換率が低いのは、DPBSと有機溶媒との間の界面面積が小さく、基質生成物の拡散速度が制限されているためであると考えられます。ハイドロゲル骨格に親水性の高いsフラグメントを組み込むことで、ハイドロゲル内部の水を効果的にロックし、有機溶媒がヒドロゲル内部にアクセスするのを防ぎ、ハイドロゲルは有機溶媒の変性効果に耐えることができます。

これらの結果は、ene媒介タンパク質ハイドロゲルが有機溶媒中での酵素反応の効果的な足場となり得ることを示しています。この自己組織化ヒドロゲルの構造的柔軟性と高い安定性により、タンパク質や動員だけでなく、バイオ燃料電池、注射可能な薬物送達担体、組織工学の足場などの他の用途にも使用できます。