生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

この方法論の全体的な目標は、細胞応答の研究に使用される固定化された生理活性空間タンパク質パターンを作成することです。この方法により、生体材料戦略を使用して生体内シグナルを反復することができます。この技術により、逐次成長因子、細胞細胞シグナル伝達、空間特異的な生化学的手がかりなどの標準的な培養方法では達成できない特定のシグナル伝達の動機を正確に模倣することができます。

このプロトコールは、基質の硬さとタンパク質のパターニングを調整するための単純な方法を提供するため、既存の方法にとって重要です。この方法は、組織工学や再生医療技術をさらに進めることができますが、組織発生や幹細胞運命などの他のシステムの研究にも適用できます。まず、主要なヒドロゲル成分であるポリエチレングリコールジアクリレート、光開始剤であるリチウムフェニル-2、4、6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸、およびECMタンパク質であるフィブロネクチンのストック溶液を、添付のテキストプロトコルに記載されている無菌条件下で調製します。

フィルターは、個々のアリコートを使用または保管する前に、0.22ミクロンのシリンジフィルターを使用して各溶液を滅菌します。次に、PEG-DA溶液をホイルで包んで光から保護します。フォトイニシエータストック溶液をホイルで包んで光から保護し、調製した溶液を摂氏4度で最大数ヶ月間保管します。

フィブロネクチン原液が凍結している場合は、滅菌アリコートを氷上で数時間または摂氏4度で一晩解凍します。まず、ゲル型ごとにポリエステルシート1枚をオートクレーブします。次に、2つのスライドガラスを各ゲル型用の3つのプラスチックスペーサーに70%エタノールで少なくとも2時間浸します。

さらに、各ゲル型用の5つのバインダークリップを70%エタノールに10分間浸します。スライドガラス、スペーサー、バインダークリップを細胞培養フードの小さなオートクレーブシートに置き、数時間風乾させます。次に、厚さ0.5mmのプラスチックスペーサーをスライドガラスの端に配置して、ヒドロゲル型を準備します。

2枚目のスライドガラスを上に置き、スペーサーをバインダークリップで隣り合わせにしっかりと固定します。最後に、金型をフードに入れ、使用前にUVライトを30分間オンにして、金型を表面滅菌します。滅菌プロセスの途中で、型を裏返してスアーにし、両方の表面を露出させます。

添付のテキストプロトコルの表1に記載されているように、ゲル前駆体溶液を作成します。次に、PEG-DA、フィブロネクチン、フォトイニシエータのボリュームを混ぜ合わせて、ハイドロゲルを作成します。溶液を激しくピペットで動かして均質な溶液を確保しますが、気泡が発生しないようにします。

ゲル型の前駆体溶液をゲル型の2つのスライドガラスの間に慎重にピペットで移します。次に、金型をUVライトの下に置き、1〜2分間露光してハイドロゲルを形成します。ゲル化したら、バインダークリップを取り外し、2つのサイドスペーサーに反対の圧力を加えて上部のスライドガラスをそっと取り外します。

次に、適切なサイズのバイオプシーパンチを使用して、ハイドロゲルサンプルを切り取ります。ゲルの長方形から複数のハイドロゲルを抜き取り、複製およびコントロールサンプルとして使用します。フォトマスクを70%エタノールに10分間浸して滅菌します。

次に、フォトマスクを細胞培養フードで風乾させます。次に、チオール化タンパク質溶液を1〜2マイクロリットル/センチメートル平方のチオール化タンパク質溶液を、切り出した各ハイドロゲルの表面にピペットで固定し、表面パターニングを行います。タンパク質溶液をハイドロゲルの表面全体に均等に広げて、タンパク質を均一に固定化することが重要です。

フォトマスクをハイドロゲルの表面に慎重に置きます。マスクをそっと押し下げて、マスクとハイドロゲル表面の間に形成される気泡を取り除きます。次に、ハイドロゲルをUVライトの下に置き、2回目のUVライトに30〜60秒間さらします。

ハイドロゲルをPBSで洗浄して未反応の種を取り除き、パターン表面が上を向くように各ハイドロゲルをウェルプレート内に配置します。次に、ジェルを摂氏4度のPBSで一晩洗います。ウェルからPBSを取り出し、次に、各ウェルに250マイクロリットルの基礎EGM2を加え、ゲルを摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。

インキュベーション中、トリプシンは標準的な技術を用いて、ほぼコンフルエントなHUVECのプレートを単一細胞懸濁液に消化します。次に、細胞懸濁液をスピンダウンし、上清を慎重に取り除きます。成長因子を添加せずに細胞ペレットと基礎EGM2を再懸濁し、細胞懸濁液の一部を血球計算盤に加えます。

細胞を数えて濃度を決定します。次に、ハイドロゲルを含むプレートを300 x Gで3分間スピンダウンして、ハイドロゲルがウェルの底に位置し、浮いていないことを確認します。ハイドロゲルがウェル内に浮かんでいないことが重要です。

フローティングハイドロゲルは、細胞播種の成功を制限し、ハイドロゲルイメージングに問題を引き起こします。ゆっくりとピペットで75, 000細胞/センチメートルを各ヒドロゲル表面の中心に二乗して、ゲルを乱さないようにします。次に、プレートを摂氏37度の細胞培養インキュベーターに入れます。

数日間、定期的にディッシュを取り外して、タンパク質パターンに応答した細胞移動を観察します。2、3日ごとにメディアの50%を交換します。ハイドロゲルを形成する際には、さまざまな前駆体PEG-ジアクリレート濃度を使用して、所望の基質剛性を得ることができます。

ここに示されているように、20%PEG-DA溶液は100キロパスカル以上の剛性と相関しています。また、光開始剤の濃度とUV露光時間の両方を考慮することも重要です。これは、いずれかの変数の増加により、リソソームの生理活性によって表される付着分子の生理活性を低下させるためです。ハイドロゲル形成中の紫外線曝露を最小限に抑えることは、その後のタンパク質固定化反応のために遊離アクリレート官能基を維持するために重要です。

紫外線に2分以上さらされたハイドロゲルは、赤で示された固定化されたタンパク質パターンを作成することができません。さらに、タンパク質パターンへのUV曝露が増加すると、より多くのタンパク質が表面に反応します。正しく調製すれば、これらのパターン化されたハイドロゲル基質上で細胞を培養し、その挙動を操作することができます。

ここでは、内皮細胞をVEGFパターンPEGハイドロゲルの表面に均一に播種しました。播種から2日後、内皮細胞は、固定化されたVEGFを含むハイドロゲルの空間領域に向かって移動することが観察されました。このプロトコルの開発後、研究者はそれを使用して任意のタンパク質またはペプチドを固定化し、in-vitro細胞システム用の新しい生理活性プラットフォームを探索することができます。

この手順を試みる際には、固定化分子の生体活性を維持するために、光開始剤の濃度とUV露光時間を最小限に抑えることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、生理活性タンパク質やペプチドをPEGハイドロゲルにパターン化し、細胞をハイドロゲル上に均一に播種し、その結果生じる細胞応答を観察する方法を十分に理解できるはずです。