生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

本手法の全体的な目的は、細胞応答の研究に使用される、固定化された生物活性空間タンパク質パターンを作成することです。この手法により、バイオマテリアル戦略を用いてin-vivo信号を再現することが可能になります。この技術を用いることで、逐次的な増殖因子、細胞間シグナリング、空間特異的な生化学的キューなど、標準的な培養法では達成できない特定のシグナリングモチーフを正確に模倣することが可能になります。

本プロトコルは、基質の剛性調整とタンパク質パターニングのための簡便な手法を提供するため、既存の手法において重要です。この手法は、組織工学や再生医療技術をさらに発展させるだけでなく、組織の発達や幹細胞の運命などの他の系の研究にも応用可能です。まず、付随するテキストプロトコルに記載されている通り、滅菌条件下で、主要なハイドロゲル成分であるpolyethylene glycol diacrylate、光開始剤であるlithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate、およびECMタンパク質であるfibronectinのストックソリューションを調製します。

個々の分注液を使用または保存する前に、0.22ミクロンのシリンジフィルターを用いて各溶液をろ過滅菌します。次に、PEG-DA溶液を遮光のためアルミホイルで包みます。光開始剤ストック溶液も遮光のためアルミホイルで包み、調製した溶液を4°Cで最大数ヶ月間保存します。

フィブロネクチンのストック溶液が凍結している場合は、滅菌した分注液を氷上で数時間、または4 °Cで一晩かけて溶解させてください。まず、ゲル型モールド1つにつき、ポリエステルシート1枚をオートクレーブで滅菌します。次に、ゲル型モールド1つにつき、ガラススライド2枚とプラスチックスペーサー3個を70% ethanolに少なくとも2時間浸漬させます。

さらに、各ゲル型につき5個のバインダークリップを70% ethanolに10分間浸します。ガラススライド、スペーサー、およびバインダークリップを細胞培養フード内の小さなオートクレーブシートの上に置き、数時間自然乾燥させます。次に、0.5 millimeter厚のプラスチックスペーサーをガラススライドの縁に配置して、ハイドロゲル型を準備します。

2枚目のガラススライドを上に重ね、バインダークリップを用いてスペーサー同士を隙間なくしっかりと固定します。最後に、使用前にモールドをフード内に入れ、UVライトを30分間点灯させて表面滅菌を行います。滅菌プロセスの途中でモールドを裏返し、両方の面が確実に照射されるようにしてください。

付属のテキストプロトコルの表1に記載されている通りに、ゲルの前駆溶液を調製します。次に、PEG-DA、フィブロネクチン、および光開始剤の各量を混合して、ハイドロゲルを作成します。溶液が均一になるようにピペットで激しく混ぜ合わせますが、気泡が入らないように注意してください。

ゲル前駆体溶液を、ゲルモールドの2枚のガラススライドの間に慎重にピペッティングします。次に、モールドをUVライトの下に配置し、1〜2分間照射してハイドロゲルを形成させます。ゲル化後、バインダークリップを取り外し、2つのサイドスペーサーに反対方向から圧力をかけて、上のガラススライドをそっと取り除きます。

次に、適切なサイズの生検パンチを用いて、ハイドロゲルのサンプルを切り出します。再現性とコントロールサンプルのため、ゲルの長方形から複数のハイドロゲルをパンチで切り出してください。フォトマスクを70%エタノールに10分間浸漬させて滅菌します。

次に、フォトマスクを細胞培養フード内で自然乾燥させます。続いて、表面パターニングのために、切り出した各ハイドロゲルの表面に、チオール化タンパク質溶液を1 cm²あたり1〜2 µLピペットで滴下します。均一なタンパク質固定化を実現するために、タンパク質溶液をハイドロゲルの表面全体に均等に広げることが重要です。

フォトマスクをハイドロゲルの表面に慎重に配置します。マスクとハイドロゲル表面の間に気泡が生じている場合は、マスクを軽く押して気泡を取り除いてください。次に、ハイドロゲルをUVライトの下に置き、30〜60秒間、2回目のUV照射を行います。

未反応物を除去するためにハイドロゲルをPBSで洗浄し、パターンの表面が上を向くように各ハイドロゲルをウェルプレート内に配置します。その後、ゲルをPBS中で4 °Cにて一晩洗浄します。ウェルからPBSを取り除き、各ウェルに250 µLの基底EGM2を加え、ゲルを37 °Cで5〜10分間インキュベートします。

インキュベーションの間、標準的な手法を用いてトリプシンにより、ほぼコンフルエントなHUVECのプレートを単一細胞懸濁液に消化します。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。細胞ペレットを成長因子を添加していない基礎EGM2で再懸濁し、細胞懸濁液の一部をヘモサイトメーターに加えます。

細胞数を計測して濃度を決定します。次に、ハイドロゲルを含むプレートを 300 x G で 3 分間遠心分離し、ハイドロゲルがウェルの底に位置し、浮遊していないことを確認します。ハイドロゲルがウェル内で浮遊していないことが極めて重要です。

ハイドロゲルの浮遊は、細胞播種における成功率を低下させ、ハイドロゲルのイメージングに問題を引き起こします。ゲルの状態を乱さないよう、各ハイドロゲル表面の中央に1cm²あたり75,000個の細胞をゆっくりとピペットで滴下してください。その後、プレートを37 °Cの細胞培養インキュベーターに入れます。

数日間にわたり、定期的にディッシュを取り出して、タンパク質パターンに応答した細胞の遊走を観察します。2〜3日ごとに培地を50%交換してください。ハイドロゲルを形成させる際、目的の基質剛性を得るために、さまざまな前駆体PEG-diacrylate濃度を使用できます。

ここで示されている20%PEG-DA溶液は、100 kilopascals以上の剛性に対応しています。また、光開始剤の濃度とUV照射時間の両方を考慮することが重要です。どちらの変数を増加させても、ここではリソソームの生物活性で表されるように、結合した分子の生物活性が低下するためです。ハイドロゲル形成時のUV照射を最小限に抑えることは、その後のタンパク質固定化反応に不可欠な、遊離のアクリレート官能基を維持するために極めて重要です。

2分を超えてUV光に曝露されたハイドロゲルでは、赤色で示されているタンパク質の固定化パターンを作成することができません。さらに、タンパク質パターンへのUV曝露量が増えるにつれて、より多くのタンパク質が表面に反応します。正しく調製された場合、これらのパターン化されたハイドロゲル基板上で細胞を培養し、その挙動を制御することが可能です。

ここでは、VEGFパターンPEGハイドロゲルの表面に血管内皮細胞を均一に播種しました。播種から2日後、血管内皮細胞がVEGFが固定化されているハイドロゲルの空間領域に向かって移動することが観察されました。このプロトコルを応用することで、研究者は任意のタンパク質やペプチドを固定化し、インビトロ細胞システムのための新しいバイオアクティブプラットフォームを探索することが可能です。

この手順を行う際は、固定化された分子の生物活性を維持するために、光開始剤の濃度とUV照射時間を最小限に抑えることが重要です。このビデオを視聴することで、PEGハイドロゲル上に生物活性タンパク質やペプチドをパターニングし、ハイドロゲル上に細胞を均一に播種し、その結果生じる細胞応答を観察する方法について十分に理解できるはずです。