カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

このプロトコールの全体的な目標は、組換え由来のエラスチン様タンパク質を発現および精製し、3D細胞カプセル化用の調整可能なハイドロゲルとして使用することです。さらに、このプロトコルは、カプセル化された細胞の共焦点顕微鏡における下流の蛍光標識の方法論を提示します。この手法は、3Dにおける細胞-細胞外マトリックス相互作用の役割の理解など、バイオマテリアル、再生医療、細胞生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、複数の細胞タイプの研究に適した、再現性があり、調整可能で、モジュール式の材料プラットフォームを提供することです。全体として、この技術の実施により、将来の細胞ベースの再生治療の成功を左右する可能性のある重要な細胞ECMシグナル伝達パラメータについての理解が深まる可能性があります。アンピシリンとクロラムフェニコールの寒天プレートに、目的のELPをコードするベクターを含む既製の細菌ストックをストリークします。

次に、縞模様のプレートを逆さまにして摂氏37度で一晩インキュベートし、細菌の増殖を可能にします。翌日、プレートから1つのコロニーを選び、予熱したスターター培養物に接種します。培養物を37°Cのシェーカーで16時間インキュベートします。

インキュベーション期間後、血清学的ピペットを使用して、20ミリリットルのスターター培養物を各発現フラスコに移します。式フラスコを1時間振ったままにします。1時間後、発現フラスコからアリコートの600ナノメートルで光学密度を測定します。

読み取り値が0.6に達したらすぐに、シェーカーの温度を摂氏32度に下げます。読み取り値が0.8に達したら、1ミリリットルの1モル滅菌ろ過IPTGを追加して、発現フラスコにELP発現を誘導します。文化を7時間表現するのを待ちます。

7時間後、フロア遠心分離機で発現培地を12, 000 x gで摂氏4度で15分間遠心分離します。遠心分離後、へらを使用して遠心分離容器から細胞ペレットを回収し、事前に秤量したジップロックバッグに入れます。次に、細胞ペレットを滅菌ろ過したTENバッファーに溶解します。

細胞ペレットをマッサージして均質な溶液を形成します。ジップロックバッグを再懸濁したセルペレットを二次容器に入れ、摂氏80度で凍結します。解凍した細胞ペレットに、細胞溶解物100ミリリットルごとに約30〜40ミリグラムのデオキシリボヌクレアーゼと1ミリリットルの100ミリモルPMSFを追加します。

ライセートを摂氏4度でシェーカーで一晩インキュベートします。3回目の凍結融解サイクルに続いて、サンプルを少なくとも15, 000 x gで摂氏4度で1時間遠心分離します。遠心分離後、遠心分離容器から上清を注ぎ、溶液を新しい遠心分離容器に移します。

上清100ミリリットルごとに、5.84グラムの塩化ナトリウムを3つの部分に分けて、最終的な1モル濃度まで追加します。懸濁液を摂氏37度の振とうインキュベーターで3時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを少なくとも15, 000 x gで摂氏37度で1時間遠心分離します。

遠心分離後、遠心分離容器から上清を捨て、ペレットを固めます。次に、遠心分離後に得られるペレット1グラムあたり10ミリリットルのオートクレーブ超純水を加えます。タンパク質が完全に溶解するように、金属スパチュラを使用してペレットをつぶし、再懸濁します。

再懸濁したペレットを摂氏4度でオービタルシェーカーで一晩インキュベートします。冷遠心分離と高温遠心分離のステップを合計3サイクル繰り返して、ELPをさらに精製します。次に、3.5キロダルトンの透析膜に残った上清を、摂氏4度の予冷超純水4リットルに対して3日間ダイアル化し、タンパク質溶液を脱塩します。

予冷した遠心分離機で最終的な透析溶液を遠心分離します。上清を摂氏80度で、あらかじめ秤量した円錐形のチューブで凍結します。最後に、凍結溶液を3日間凍結乾燥し、最終的な凍結乾燥製品を秤量してタンパク質収量を決定します。

生検パンチを使用して、厚さ0.5ミリメートルのシリコンシートに穴を開けます。次に、各穴の周りに正方形を切り取ります。次に、ピンセットを使用して、個々の型の両側にあるプラスチックラップを取り除きます。

ラップを取り外した後、ピンセットを使用して、同じ数の裸のシリコン型とガラスカバースリップを48ウェルプレートの蓋に交互に並べて配置し、その後のプラズマボンディングを行います。すべての細胞培養材料が作製された後、下流のハイドロゲルカプセル化のための目的の細胞タイプの調製を開始できます。細胞を単一細胞懸濁液に解離した後、1.5ミリリットルの遠心チューブに所望の細胞数を分注します。

次に、細胞を約200 x gで3分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを氷上に保存します。細胞ペレットをELPストック溶液に再懸濁し、最終容量の80%まで再懸濁します。

次に、ピペットを使用して溶液をELP中の細胞の均一な懸濁液に混合します。残りの20%の最終容量については、THPCストック溶液をセルELP懸濁液に加えます。気泡の形成を避けながら、均質な混合物の形成を確実にするために、数回ピペットを動かします。

次に、円を描くように、セルELP THPC混合物を24ウェルプレートの各型にピペットで移します。次に、サンプルを室温で15分間インキュベートします。15分後、サンプルを摂氏37度でさらに15分間インキュベートします。

インキュベーションが終了したら、24ウェルプレートの各ウェルに750マイクロリットルの温かい細胞培養培地を慎重に加えます。ハイドロゲルを摂氏37度で所望の培養時間放置します。まず、各ウェルから培地を吸引します。

次に、1ミリリットルの温かいDPBSでウェルを洗います。洗浄終了後、各ウェルに750マイクロリットルの固定液を加えます。次に、24ウェルプレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、各ウェルから固定液を吸引し、固定液を有害廃棄物容器に廃棄します。次に、1ミリリットルのDPBSをサンプルに加え、すぐにDPBSを有害廃棄物容器に廃棄します。次に、750マイクロリットルの透過処理溶液を添加し、ロッカー上で室温で1分間15回転でサンプルを透過処理します。

1時間後、透過化溶液を吸引し、サンプルに750マイクロリットルのブロッキング溶液を加えます。サンプルをロッカーに室温で3時間放置します。次に、目的の一次抗体を抗体希釈溶液で希釈します。

次に、各サンプルに500マイクロリットルの抗体溶液を加えます。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、一次抗体溶液を吸引し、サンプルをPBSTで室温で15回転/分で1時間3回洗浄します。

次に、適切な二次抗体をDAPI原液1ミリリットルあたり5ミリグラムで希釈し、最終濃度が1ミリリットルあたり2.5マイクログラムになるようにします。次に、各サンプルに500マイクロリットルの溶液を追加します。次に、アルミホイルを使用して24ウェルプレートを覆い、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、二次抗体溶液を吸引し、サンプルをPBSTで3回ずつ、室温でロッカーで30分間洗浄します。次に、スライドガラスの表面にハードセット封入剤を滴下し、サンプルを封入剤の上に置きます。最後に、マニキュアを使用してサンプルをスライドガラスカバーに密封し、汚染やサンプルの移動を防ぎます。

ここでは、SDS-PAGEとウェスタンブロット分析の両方で、制御された条件下での全長ELPによる標的タンパク質の発現が、37キロダルトンのバンドの存在によって検証されます。しかし、制御されていない条件下では、ウェスタンブロットを使用していくつかの低分子量バンドも観察されます。低分子量バンドは、エラスチン様ドメインのリピートが4つ未満のタンパク質に対応しており、タンパク質が発現中に完全に翻訳されていないことを示しています。

この結果は、摂氏32度を超える表現を行う場合に一般的です。ハイドロゲルの機械的特性を一定に保ちながら細胞接着リガンドの濃度を変化させるために、フィブロネクチン由来の細胞接着体と非細胞接着配列を含むELPバリアントの比率を調整します。さらに、マウス神経前駆細胞は、3%ELPヒドロゲルにカプセル化した場合、7日間にわたって生存可能である。

生細胞はカルセインAM染色により緑色で識別されますが、赤色のエチジウムホモダイマーは死細胞に優先的に取り込まれます。神経前駆細胞の幹細胞表現型を検証するために、Sox2やネスチンなどの標準的なマーカーの発現も、細胞を3D ELPハイドロゲルにカプセル化した際の免疫染色によって可視化します。このビデオを見れば、さまざまな細胞タイプの下流カプセル化のためのエラスチン様タンパク質の発現および精製方法について十分に理解できるはずです。さらに、細胞表現型の調節における3D微小環境の役割についても検討することができます。