Name: カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学ぶエラスチン様タンパク質の発現・精製法と3D細胞カプセル化、蛍光標記による共焦点顕微鏡観察の手法。細胞外基質との相互作用を制御環境で研究し、再生医療への応用可能性を探る。

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著者に感謝 t. パーマーと H. バブー (スタンフォード大学脳神経外科)図4 マウスの Npc。 ベクター アートを提供するために使用され、クリエイティブ ・ コモンズ表示 3.0 Unported ライセンス (https://creativecommons.org/ の下で仏医術から適応licenses/by/3.0/legalcode)。この作業の一環で、スタンフォード大学ナノ共有施設 (SNSF)、賞 ECCS 1542152 下の国立科学財団によってサポートを行った。N.A.S. は、サポートから国立科学研究所の一般医療の健康の国民の協会 (32 GM 008412) を認めています。C.M.M. は、博士フェローシップ (F31 EB020502) と Siebel 学者プログラムの NIH NRSA からサポートを認めています。S.C.H. では、再生医療 (RT3-07948)、国立衛生研究所 (U19 AI116484 と R21 EB018407)、全米科学財団 (DMR 1508006)、およびカリフォルニア工科大学からサポートを認めています。この研究は、ユーニス · ケネディ · シュライバー国立衛生研究所の子と人間の開発 (NICHD)、国立研究所によってサポートされている再生のリハビリテーション研究・ トレーニング (AR3T)、連合から資金を受けてください。神経疾患と脳卒中 (NINDS)、医用イメージング、生体 (NIBIB) 賞を受賞番号 P2CHD086843 の下で健康の国立研究所の国立研究所。内容は著者の責任と健康の国民の協会の見解を必ずしも表さない。

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組換え蛋白質の表現および浄化は、再現性の高い生体材料を合成する強力なツールです。商品化された分子クローニングの出現を主因カスタム プラスミド購入できますいくつかのサプライヤーから ELPs のような材料で作業時間を大幅に削減します。同様に、元の仕事は、連邦契約によって支えられた非営利使用するため今後の作業になりますとプラスミドを元の研究室から直接要求できます。ELP の完全なアミノ酸シーケンスは、いくつかの ELP の亜種31以前公開されています。しかし、式から組換え蛋白質の最終的な浄化のプロセスは一般的に還元利回りや低品質の製品につながることができます重要な手順の数を含みます。ELP の準備のための最も一般的な問題のいくつかは、次のいずれかで発生する: 細菌の膜と熱サイクルを通じて (3) 蛋白質の浄化を妨害する、ストアドの細菌の在庫の品質 (1) (2) の最初の凍結融解サイクルします。
蛋白質の表現および他非生物材料の生産の手段の主な違いは我々 がポリマーを合成する遺伝子組換えホストの生物学的機械を活用しています。その後、このテ...

過去世紀にわたって基礎的な細胞生物学の研究のための不可欠なツールセットに二次元 (2 D) 組織文化を開発しました。さらに、2 D の細胞培養のため比較的低コストでシンプルなプロトコルは、多くの生物的および医学の分野での採用につながっています。しかし、過去の研究を示しています伝統的な 2 D のプラットフォームは、それら収集した体内から著しく逸脱、原因の貴重な時間と資金を無駄に臨床的に方向づけられた研究1,2のための結果につながること 3。我々 と他のこの不一致は最適な増殖と種々 の細胞の成熟に必要なことができる 2D サーフェス上で培養した細胞に提供されるネイティブ生化学的および生物物理学的手がかりの不足に帰因するかもしれないことを仮定します。
これらの制限および助け橋 2 D の間のギャップに対処するための in vitroとin vivoの研究、研究者がある電池封止材1,4,5 の開発した三次元 (3 D) ゲル プラットフォーム ,6。ヒドロゲルは細胞外マトリックス (ECM) の生体内での組織のような機械的性質と栄養素の急速な輸送を可能にする構造の水膨潤により内因性の微小環境を要約する理想的な材料と7,8の要因シグナリングします。さらに、足場の力学的および生化学的特性を独立に制御する 3 D ゲルを設計できます。行列力学9,10、11,12と細胞接着配位子13,14,15の両方がよくセルに影響を与える知られています。生体外で動作し、体内。したがって、可変プロパティと 3 D ゲルは、セルとその微小環境の因果関係を研究するためのプラットフォームを提供しています。理想的な 3 D ゲルのマトリックスのための基準は、単純な非細胞電池封止材、生理学的に関連する機械的性質の独立した可変性およびネイティブな細胞接着モチーフの模倣者に含まれます。
両方合成 (e.g、ポリエチレング リコール、ポリ乳酸、ポリ (グリコール酸)) および自然由来 (e.g。、アルギン酸、コラーゲン、マトリゲル) ヒドロゲル文化プラットフォーム 2D体外に利点があります。しかし、また適用性を限る重大な欠点があります。まず、合成と天然物由来の多くのプラットフォームが必要な哺乳類細胞に潜在的に有毒することができます過酷な架橋条件につながる減少した細胞の生存率の7。また、多くの合成プラットフォームはネイティブ活性を欠いている、増加コストと複雑さの16を追加することができますセカンダリの化学反応によって修飾する必要があります。最後に、天然由来原料は通常本質的な生体活性ドメインを含みますが、しばしば高いバッチごとに変動に悩まされているため、比較的弱いゲル7,17を形成に制限が多い。
組換えタンパク質工学タンパク質シーケンスを明示的に制御により材料設計のためのユニークなツールセットを提示し、延長によって、最終的なハイドロゲルの潜在的な力学的および生化学的特性足場18。また、エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 蛋白質を表現するためのよく知られている生物学的機械を活用し、材料生産できる低コストで一貫して限られたインター-内-バッチ可変。ここで紹介するエラスチン様タンパク質 (ELP) は 3 つのエンジニア リング ドメイン: 抗体のタグを介して蛍光ラベリングを可能に (1) の T7 および His6 タグ、弾性力学特性を付与し、化学のエラスチンのような地域 (2)架橋、(3) 細胞接着モチーフのエンコード 'バイオ アクティブ' 地域。
エラスチンのような地域は、'効きます' アミノ酸サイト イソロイシン (イル) がある可能性がありますの 4 つはプロリンを除くすべてのアミノ酸に設計されている標準 (ヴァル Pro Gly 効きます-ペプチド-)5エラスチン シーケンスに基づいています。このシーケンスは、熱循環19,20を介して簡単な浄化後式の利用できる下の臨界溶液温度 (LCST) 行動と遺伝子組換え ELPs を与えます。この LCST プロパティは、異なる温度で熱骨材へゲスト '効きます' 残渣21,22を変更することでチューニングできます。
ここでは、5 つのエラスチンのような繰り返しの 1 つに「効きます」位置はリシン (Lys) アミノ酸のアミン提示酸架橋ハイドロゲルを利用されるに置き換えられていますいます。我々 の以前の仕事は、アミン反応性架橋剤テトラキス (ヒドロキシメチル) ホスホニウム塩 (THPC)23の反応特異性と堅牢な架橋を示しています。さまざまな全体蛋白質内容と架橋剤濃度による、生理学的に関連する剛性の範囲 (~0.5-50 kPa)9,23,24にまたがることチューニングできるゲルを生成することができるがおります。機械的特性をチューニングに加えて ELP 蛋白質のバックボーン内の標準的な細胞接着ドメインの統合から、ハイドロゲル内細胞接着の結果します。たとえば、非バインド 'RDGS' バリアント拡張フィブロネクチン由来 'RGDS' アミノ酸シーケンスの組み込むことで柔軟な形態、スクランブル中の細胞接着と細胞-マトリックス接着24が制限されます。総蛋白濃度と同様に、非接着タンパク質に細胞接着の比率を調節することによって効果的に配位子濃度の広い範囲でゲルを生成することができるがおります。その結果、種々 の細胞の最適な 3 D 文化のため個別にチューニングできる分離された生化学的および生物物理プロパティを持つハイドロゲル プラットフォームを開発しました。
剛性マトリックスと接着性リガンドの可変性に加え組換えヒドロゲルは細胞拡散、増殖、および4の 3 D のコンテキスト内での移行に必要なデザイン特定の材料劣化プロファイル機能を提供します。,9. この劣化は拡張 'RGDS'9またはエラスチンのようなシーケンス25を標的プロテアーゼの細胞分泌によって与えられます。ELP ヒドロゲルは、細胞生存率及び量的な逆の DNA ・ RNA ・ タンパク質抽出と同様に、免疫細胞化学を含む関数を勉強するために必要なその後の生化学的アッセイをサポートに示されています。トランスクリプション ポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) と西9 をしみ。ELP の亜種も、生体内でのモデルの数で使用されているし、免疫システム26忍容性が知られています。
一緒に取られて、ELP 電池封止材研究材料プラットフォームを誇るさまざまな生化学的および生物物理可変性のと同じ程度に欠ける、合成や天然物由来の素材プラットフォームと比較しての利点として、再現性。さらに、ELP のシンプルで非細胞毒性を使用さまざまな種類の細胞 (e.gひよこ後根神経節14,24、マウス神経前駆細胞9、ヒト間葉系幹細胞27、牛。新生児軟骨細胞28、ひと血管内皮細胞細胞29,30) 2 D 細胞培養と比較して内因性 3 D ECM のもっと生理学的に関連するモデルのことができます。ここで、recombinantly 由来の表現のためのプロトコルを提案する、3 d 可変ハイドロゲルのプラットフォームとして使用するための非細胞カプセル化。さらにダウン ストリームの蛍光標識とカプセル化された細胞の共焦点顕微鏡観察の方法論を提案します。

<table><tbody><tr><td>エラスチン様タンパク質の発現と精製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10cmシャー</td><td>レ サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>RICCAケミカル</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3920-500G</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1760-25G</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>9002-18-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS コンピテントセル</td><td>インビトゲン</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>アムレスコ</td><td>0230-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩、二水和物</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>O2793-500</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1755-10G</td><td></td></tr><tr><td>ルリアブロス</td><td>EMDミリポア</td><td>1.10285.5007</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>VWR52858-000</td><td></td><td></td></tr>フェ<tr><td>ニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)</td><td>MPバイオメディカル195381</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358-212</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S 8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター ユニット (0.22 &mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Millipore</td><td>71754-4</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;mシリンジフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0.5mm厚シリコンシート</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70338-05</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル組織培養プレート&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て生検パンチ(2 mm)</td><td>インテグラミルテックス</td><td>33-31</td><td></td></tr>使い捨て<tr><td>生検パンチ(4 mm)</td><td>インテグラミルテックス</td><td>33-34</td><td></td></tr>使い捨て<tr><td>生検パンチ(5 mm)</td><td>インテグラミルテックス</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ 'リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>No. 1 12 mm ガラスカバースリップ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Tryspin/EDTA</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>3D ELPハイドロゲルにおける細胞の免疫細胞化学</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% (w/v) パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15701</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>ロシュ</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>分子プローブ</td><td>D1306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Lampire Biological Labs</td><td>7332100</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse 二次抗体 (AF488)</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit 二次抗体 (AF546)</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11071</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Nestin Primary Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>556309</td><td></td></tr><tr><td>マウス Sox2 一次抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>23064S</td><td></td></tr><tr><td>マニキュア</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield ハードセット 封入剤&nbsp;</td><td>ベクターラボ</td><td>H-1400&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

カプセル化と 3 d の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

二次元 (2 D) 組織培養技術は、基礎的な細胞生物学の私達の理解に不可欠されています。ただし、従来の 2次元培養システムに欠けて結果の間で重要な結果として、三次元 (3 D) マトリックス切断収集の in vitroおよびin vivo。この制限に対処するため、研究者は体内細胞微小環境の生化学的および生物物理学的特性を模倣することができます 3 D のハイドロゲル培養プラットフォームを設計しました。この研究、3 D の細胞のカプセル化と下流の生化学的アッセイをサポートする材料のプラットフォームを開発する必要が動機となった。組換えタンパク質工学 3 D ゲル材料の設計と開発のユニークなツールセットを提供は、蛋白質シーケンスの特定のコントロールを可能にするあり、拡張子、合力の潜在的な力学的および生化学的特性行列。ここでは、recombinantly 由来エラスチン様タンパク質 (ELP) 独立可変の機械的性質と細胞接着リガンド濃度フォーム ヒドロゲルを使用ことができますの表現のためのプロトコルを提案する.さらに ELP ヒドロゲル内細胞のカプセル化の方法論を提案して、下流の分析と定量化のための細胞を埋め込まれたの後蛍光抗体染色します。

このプロトコルで使われる ELPs は 5 つの地域から成る: T7 タグ、His6 タグ、enterokinase (EK) 胸の谷間サイト、バイオ アクティブ領域およびエラスチンのような地域 (図 1)。T7 と His6 タグは、標準的な西部のしみの技術によって簡単に識別できます。EK の胸の谷間のサイトの紹介はタグ領域の酵素の除去のため必要な場合ことができます。バイオ アクティブ領域を拡張、フィブロネクチン由来の細胞接着 ('RGDS') または非接着剤 ('RDGS') シーケンスにエンコードします。最後に、エラスチンのような地域の中心部の繰り返しには THPC を介して架橋有効になり並ぶの繰り返しを含むイソロイシン31~ 32 ° C の LCST を達成するために、ゲストの残渣サイトでリジン グループが含まれています。
投稿式、SD...

組換え蛋白質設計ヒドロゲルは、ポリマー主鎖としたがって、細胞の微小環境の完全な可変性を可能にする彼ら 3 D 細胞培養のために有利です。ここでは、組換えのエラスチンのような蛋白質の浄化のプロセスと 3 D ゲル電池封止材への応用について述べる。

カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

このプロトコールの全体的な目標は、組換え由来のエラスチン様タンパク質を発現および精製し、3D細胞カプセル化用の調整可能なハイドロゲルとして使用することです。さらに、このプロトコルは、カプセル化された細胞の共焦点顕微鏡における下流の蛍光標識の方法論を提示します。この手法は、3Dにおける細胞-細胞外マトリックス相互作用の役割の理解など、バイオマテリアル、再生医療、細胞生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、複数の細胞タイプの研究に適した、再現性があり、調整可能で、モジュール式の材料プラットフォームを提供することです。全体として、この技術の実施により、将来の細胞ベースの再生治療の成功を左右する可能性のある重要な細胞ECMシグナル伝達パラメータについての理解が深まる可能性があります。アンピシリンとクロラムフェニコールの寒天プレートに、目的のELPをコードするベクターを含む既製の細菌ストックをストリークします。次に、縞模様のプレートを逆さまにして摂氏37度で一晩インキュベートし、細菌の増殖を可能にします。翌日、プレートから1つのコロニーを選び、予熱したスターター培養物に接種します。培養物を37°Cのシェーカーで16時間インキュベートします。インキュベーション期間後、血清学的ピペットを使用して、20ミリリットルのスターター培養物を各発現フラスコに移します。式フラスコを1時間振ったままにします。1時間後、発現フラスコからアリコートの600ナノメートルで光学密度を測定します。読み取り値が0.6に達したらすぐに、シェーカーの温度を摂氏32度に下げます。読み取り値が0.8に達したら、1ミリリットルの1モル滅菌ろ過IPTGを追加して、発現フラスコにELP発現を誘導します。文化を7時間表現するのを待ちます。7時間後、フロア遠心分離機で発現培地を12, 000 x gで摂氏4度で15分間遠心分離します。遠心分離後、へらを使用して遠心分離容器から細胞ペレットを回収し、事前に秤量したジップロックバッグに入れます。次に、細胞ペレットを滅菌ろ過したTENバッファーに溶解します。細胞ペレットをマッサージして均質な溶液を形成します。ジップロックバッグを再懸濁したセルペレットを二次容器に入れ、摂氏80度で凍結します。解凍した細胞ペレットに、細胞溶解物100ミリリットルごとに約30〜40ミリグラムのデオキシリボヌクレアーゼと1ミリリットルの100ミリモルPMSFを追加します。ライセートを摂氏4度でシェーカーで一晩インキュベートします。3回目の凍結融解サイクルに続いて、サンプルを少なくとも15, 000 x gで摂氏4度で1時間遠心分離します。遠心分離後、遠心分離容器から上清を注ぎ、溶液を新しい遠心分離容器に移します。上清100ミリリットルごとに、5.84グラムの塩化ナトリウムを3つの部分に分けて、最終的な1モル濃度まで追加します。懸濁液を摂氏37度の振とうインキュベーターで3時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを少なくとも15, 000 x gで摂氏37度で1時間遠心分離します。遠心分離後、遠心分離容器から上清を捨て、ペレットを固めます。次に、遠心分離後に得られるペレット1グラムあたり10ミリリットルのオートクレーブ超純水を加えます。タンパク質が完全に溶解するように、金属スパチュラを使用してペレットをつぶし、再懸濁します。再懸濁したペレットを摂氏4度でオービタルシェーカーで一晩インキュベートします。冷遠心分離と高温遠心分離のステップを合計3サイクル繰り返して、ELPをさらに精製します。次に、3.5キロダルトンの透析膜に残った上清を、摂氏4度の予冷超純水4リットルに対して3日間ダイアル化し、タンパク質溶液を脱塩します。予冷した遠心分離機で最終的な透析溶液を遠心分離します。上清を摂氏80度で、あらかじめ秤量した円錐形のチューブで凍結します。最後に、凍結溶液を3日間凍結乾燥し、最終的な凍結乾燥製品を秤量してタンパク質収量を決定します。生検パンチを使用して、厚さ0.5ミリメートルのシリコンシートに穴を開けます。次に、各穴の周りに正方形を切り取ります。次に、ピンセットを使用して、個々の型の両側にあるプラスチックラップを取り除きます。ラップを取り外した後、ピンセットを使用して、同じ数の裸のシリコン型とガラスカバースリップを48ウェルプレートの蓋に交互に並べて配置し、その後のプラズマボンディングを行います。すべての細胞培養材料が作製された後、下流のハイドロゲルカプセル化のための目的の細胞タイプの調製を開始できます。細胞を単一細胞懸濁液に解離した後、1.5ミリリットルの遠心チューブに所望の細胞数を分注します。次に、細胞を約200 x gで3分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを氷上に保存します。細胞ペレットをELPストック溶液に再懸濁し、最終容量の80%まで再懸濁します。次に、ピペットを使用して溶液をELP中の細胞の均一な懸濁液に混合します。残りの20%の最終容量については、THPCストック溶液をセルELP懸濁液に加えます。気泡の形成を避けながら、均質な混合物の形成を確実にするために、数回ピペットを動かします。次に、円を描くように、セルELP THPC混合物を24ウェルプレートの各型にピペットで移します。次に、サンプルを室温で15分間インキュベートします。15分後、サンプルを摂氏37度でさらに15分間インキュベートします。インキュベーションが終了したら、24ウェルプレートの各ウェルに750マイクロリットルの温かい細胞培養培地を慎重に加えます。ハイドロゲルを摂氏37度で所望の培養時間放置します。まず、各ウェルから培地を吸引します。次に、1ミリリットルの温かいDPBSでウェルを洗います。洗浄終了後、各ウェルに750マイクロリットルの固定液を加えます。次に、24ウェルプレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルから固定液を吸引し、固定液を有害廃棄物容器に廃棄します。次に、1ミリリットルのDPBSをサンプルに加え、すぐにDPBSを有害廃棄物容器に廃棄します。次に、750マイクロリットルの透過処理溶液を添加し、ロッカー上で室温で1分間15回転でサンプルを透過処理します。1時間後、透過化溶液を吸引し、サンプルに750マイクロリットルのブロッキング溶液を加えます。サンプルをロッカーに室温で3時間放置します。次に、目的の一次抗体を抗体希釈溶液で希釈します。次に、各サンプルに500マイクロリットルの抗体溶液を加えます。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、一次抗体溶液を吸引し、サンプルをPBSTで室温で15回転/分で1時間3回洗浄します。次に、適切な二次抗体をDAPI原液1ミリリットルあたり5ミリグラムで希釈し、最終濃度が1ミリリットルあたり2.5マイクログラムになるようにします。次に、各サンプルに500マイクロリットルの溶液を追加します。次に、アルミホイルを使用して24ウェルプレートを覆い、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、二次抗体溶液を吸引し、サンプルをPBSTで3回ずつ、室温でロッカーで30分間洗浄します。次に、スライドガラスの表面にハードセット封入剤を滴下し、サンプルを封入剤の上に置きます。最後に、マニキュアを使用してサンプルをスライドガラスカバーに密封し、汚染やサンプルの移動を防ぎます。ここでは、SDS-PAGEとウェスタンブロット分析の両方で、制御された条件下での全長ELPによる標的タンパク質の発現が、37キロダルトンのバンドの存在によって検証されます。しかし、制御されていない条件下では、ウェスタンブロットを使用していくつかの低分子量バンドも観察されます。低分子量バンドは、エラスチン様ドメインのリピートが4つ未満のタンパク質に対応しており、タンパク質が発現中に完全に翻訳されていないことを示しています。この結果は、摂氏32度を超える表現を行う場合に一般的です。ハイドロゲルの機械的特性を一定に保ちながら細胞接着リガンドの濃度を変化させるために、フィブロネクチン由来の細胞接着体と非細胞接着配列を含むELPバリアントの比率を調整します。さらに、マウス神経前駆細胞は、3%ELPヒドロゲルにカプセル化した場合、7日間にわたって生存可能である。生細胞はカルセインAM染色により緑色で識別されますが、赤色のエチジウムホモダイマーは死細胞に優先的に取り込まれます。神経前駆細胞の幹細胞表現型を検証するために、Sox2やネスチンなどの標準的なマーカーの発現も、細胞を3D ELPハイドロゲルにカプセル化した際の免疫染色によって可視化します。このビデオを見れば、さまざまな細胞タイプの下流カプセル化のためのエラスチン様タンパク質の発現および精製方法について十分に理解できるはずです。さらに、細胞表現型の調節における3D微小環境の役割についても検討することができます。

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、合成ハイドロゲル内の細胞の3次元（3D）カプセル化するためのプロトコルを提示する。カプセル化手順は、次の2つの一般的に使用される架橋の方法（マイケル型の加算と光 -...

組織工学のための3Dハイドロゲルの細胞のカプセル化

このビデオは、3Dハイドロゲルにカプセル化された細胞を免疫染色する技術を示しています。神経前駆細胞を含むハイドロゲル培養物を固定し、透過処理し、ブロッキング溶液で処理して非特異的免疫染色を防止します。一次抗体カクテルを添加して特定のタンパク質に結合し、続いて蛍光標識二次抗体と核染色剤を添加します。次に、サンプルをスライドにマウントし、共焦点顕微鏡で観察します。...

3Dハイドロゲルシステムにカプセル化された細胞の免疫染色

コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。...

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

私たちは、三次元細胞培養アプリケーションのための合成ハイドロゲルマトリックスの光媒介形成とその後の生化学的パターニングの連続的なプロセスについて説明します。細胞適合性フォトクリックケミストリーによるハイドロゲルの構築と修飾が実証されています。さらに、これらのハイドロゲル内のパターンを定量化および観察し、細胞生存率を決定するための容易な技術が紹介されています。...

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

これは、肺の細胞外マトリックスからの3次元細胞培養の足場を作成するための方法です。無傷の肺は、三次元での細胞の増殖を支持することができるヒドロゲルに加工されます。...

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

蛋白質ベースのヒドロゲルの三次元のアーキテクチャを操作するさまざまな方法は、材料特性に関してここで評価されます。マクロポーラス ネットワーク修飾が細胞接着ペプチドと細胞培養での実現性は、2...

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

このプロトコルは、cryogelation の技術で微細加工を統合することにより弾性三次元多孔体 microcryogels の作製をについて説明します。セルの読み込み、時に、容易に注入の生体内再生治療を容易にすることができますまたは高スループット薬剤スクリーニングの in vitroの配列に組み立てに 3 D...

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

ここで動的イミン化学を用いたキトサン ベース注射ゲルの作製について述べる。ハイドロゲルの機械的強度と 3 D...

キトサンを用いた注射ゲルおよび 3 D 細胞培養への応用の準備

ヒドロゲル形成中のせん断処理は、剪断薄いが剪断力の除去後に急速に再構築するミクロゲル懸濁液の生成をもたらす。このような材料は、バイオプリンティング複合体、細胞を含んだ構造のための支持マトリックスとして使用されてきた。ここでは、支持床および適合バイオインクを製造するために使用される方法が説明される。...

懸濁3Dバイオプリンティングのためのゲル化中のせん断処理によって形成されたアガロース流体ゲル

本稿では、フォトチューナブルハイドロゲルを3Dバイオプリントして、細胞外マトリックスの硬化と線維芽細胞の活性化を研究する方法について説明します。...

線維芽細胞の活性化を研究するための3Dバイオプリンティング用フォトチューナブルハイドロゲル

学ぶエラスチン様タンパク質の発現・精製法と3D細胞カプセル化、蛍光標記による共焦点顕微鏡観察の手法。細胞外基質との相互作用を制御環境で研究し、再生医療への応用可能性を探る。

カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

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