Profils MicroRNA d'expression de cellules iPS humaines, l'épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

L’objectif général de cette procédure est de comparer l’expression des micro-ARN dans les cellules souches pluripotentes induites. Cellules épithéliales pigmentées rétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes induites et de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes fœtales. Ceci est accompli en cultivant et en développant d’abord des cellules IPS et des EPR fœtales.

La deuxième étape consiste à différencier les cellules IPS en EPR. Ensuite, l’ARN est extrait des cellules IPS, des cellules I-P-S-R-P-E et des cellules EPR fœtales. La dernière étape consiste à effectuer une analyse de micro-ADN sur les échantillons d’ARN et à analyser les données.

En fin de compte, l’analyse des voies et des réseaux est utilisée pour identifier les microARN exprimés de manière différentielle qui sont impliqués dans plusieurs réseaux cellulaires, y compris la prolifération et la progression du cycle cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur la vision, telles que le rôle des micro-ARN dans la régulation de la différenciation en progression du cycle cellulaire de l’EPR mature, la prolifération et la sénescence. L’implication de cette technique s’étend à la thérapie utilisée dans l’épithélium pigmentaire de la rétine dérivé de cellules souches pour remplacer la maladie ou les dommages à l’EPR, car le nombre de passage Optima de la cellule utilisée par la thérapie peut être déterminé.

Bien que cette question puisse donner un aperçu des facteurs qui régulent la différenciation de la PRR de l’IPS. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes d’organes tels que la différenciation d’autres types de cellules spécifiques de TC à partir de l’IPS. Pour commencer cette procédure, placez les cellules souches pluripotentes induites à environ 350 colonies cellulaires par puits sur une plaque nouvellement recouverte dans un milieu testeur M, et permettez aux colonies IPSL de se développer pendant quatre à cinq jours en culture.

Ensuite, tous les trois jours, remplacez le M tesser un média par quatre millilitres de média de différenciation et remplacez la moitié du média par un nouveau milieu de différenciation. Laissez les foyers pigmentés devenir suffisamment grands pour être disséqués manuellement hors de la culture, ce qui prend environ 40 à 50 jours. Utilisez ensuite une pointe de pipette de 200 microlitres pour couper et soulever les colonies pigmentées.

Recueillez et mettez en commun les colonies disséquées dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez cinq millilitres de média DMMF 12 dans les cellules EPR regroupées et centrifugez à 300 GS toutes les cinq minutes. Ensuite, retirez le média et mettez en suspension la pastille de cellule dans cinq millilitres de milieu et répétez la centrifugation.

Retirez le support de la pastille de cellule. Préparez ensuite une solution à cellule unique en incubant l’I-P-S-R-P-E mélangé avec 0,25 % de TRIPSIN EDTA pendant cinq à 10 minutes, A 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les amas de cellules se dissocient en cellules uniques. Rincez les cellules I-P-S-R-P-E avec un milieu I-P-S-R-P-E, puis placez les cellules collectées sur une plaque fraîche enrobée de matrigel dans quatre millilitres de culture de milieu I-P-S-R-P-E, les cellules pendant trois semaines avant le passage et changez le milieu avec un milieu I-P-S-R-P-E frais tous les trois jours pour l’expérience.

Voir les cellules I-P-S-R-P-E à 100 000 cellules par centimètre carré, puis collecter les cellules 17 jours après l’ensemencement pour la collecte de cellules IPS indifférenciées. Culture, les cellules jusqu’à ce que des colonies indifférenciées soient observées être denses au centre. Lorsque cela est observé, rincer les colonies dans un milieu D-M-E-M-F 12, puis dissocier les cellules IPS en cellules uniques à l’aide d’Accutane.

Collectez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez-les à 300 G pendant cinq minutes. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans deux millilitres de milieu D-M-E-M-F 12 pour recueillir l’EPR fœtal, rincer d’abord les cultures de cellules EPR fœtales avec D-M-E-M-F 12. Ensuite, dissociez les cultures cellulaires en cellules uniques à l’aide de 0,25 % d’EDTA TRIPSIN pendant cinq à 10 minutes, à 37 degrés Celsius.

Prélever les cellules EPR fœtales dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger à 300 GS pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire. Dans deux millilitres de milieu D-M-E-M-F 12.

Récupérez les cellules I-P-S-R-P-E le jour 17. Après le passage trois et le passage cinq, rincez deux fois les cellules I-P-S-R-P-E dans du PBS et préparez une suspension unicellulaire par incubation avec un millilitre de trypsine à 0,25 % pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, neutralisez la trypsine avec deux millilitres de milieu I-P-S-R-P-E glacé et collectez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.

Centrifugez le tube pendant cinq minutes à 300 G, puis aspirez le snat. Mettez à nouveau en suspension la pastille de cellule dans trois millilitres de tampon de coloration à partir de la centrifugeuse du kit de microbilles, la suspension de cellule I-P-S-R-P-E dans le tampon de coloration à 300 GS pendant cinq minutes. Aspirez ensuite le surnageant et le réusateur.

Suspendez la pastille cellulaire à une concentration de deux fois 10 aux six cellules par 100 microlitres du tampon de coloration du kit de microbilles. Ajoutez 10 microlitres d’anticorps anti TRA, un anticorps 60 PE par deux fois 10 aux six cellules. Bien mélanger puis incuber à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Lavez les cellules dans un millilitre de tampon de coloration pour deux fois 10 des six cellules. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire pendant 10 minutes à 300 fromages. Ensuite, aspirez et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 80 microlitres de tampon de coloration par deux fois 10 aux six cellules.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de microbilles marquées anti PE par deux fois 10 aux six cellules. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ajouter un millilitre de tampon de coloration toutes les deux fois 10 dans la centrifugeuse à six cellules pendant 10 minutes à 300 G et aspirer le surnageant.

Ensuite, mettez en suspension la pastille de cellule dans 500 microlitres de tampon de coloration et triez pour TRA une cellule négative de 60 cellules dans un trieur de cellules magnétiques comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement, en faisant passer chaque échantillon dans une mini-colonne de spin d’homogénéisateur de micro-centrifugeuse disponible dans le commerce, conçue pour les mini-préparations d’acides nucléiques. Ensuite, extrayez l’ARN total des cellules IPS, I-P-S-R-P-E et de l’EPR fœtal à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN disponible dans le commerce. Conçu pour préserver les petites molécules d’ARN.

L’utilisation d’un spectrophotomètre NanoDrop pour déterminer les concentrations totales d’ARN peut créer un fichier Excel avec une liste des microARN qui ont été identifiés comme ayant au moins deux niveaux d’expression différents entre les groupes d’échantillons. Connectez-vous ensuite au programme d’analyse des voies d’ARN en ligne et téléchargez le fichier Excel. Sélectionnez le format flexible pour le format de fichier et sélectionnez Agilent dans la liste déroulante pour l’identifiant.

Saisissez du texte sous l’en-tête des données brutes. Attribuez l’ID à la colonne ID de la sonde et affectez l’observation un et le rapport logarithmique à la colonne du rapport logarithmique. Sélectionnez Ignorer pour toutes les autres colonnes.

Sélectionnez les paramètres d’analyse comme suit, le degré de confiance observé expérimentalement n’inclut que les relations directes et indirectes et inclut les produits chimiques endogènes. Sélectionnez la base de connaissances Ingéniosité comme jeu de référence. Choisissez ensuite la base de données des molécules de référence.

Cela inclut les données de toutes les espèces, de toutes les lignées cellulaires et de tous les tissus et de toutes les mutations. Après avoir sélectionné tous les paramètres, exécutez l’analyse du réseau en sélectionnant réseaux. Sélectionnez ensuite les réseaux qui se chevauchent, puis cliquez sur un réseau qui vous intéresse pour voir les résultats.

Les cellules IPS qui ont été différenciées en cellules I-P-S-R-P-E ont présenté le phénotype RPE classique de la morphologie cellulaire pigmentée hexagonale, qui est similaire à la comparaison du profil d’expression des micro-ARN des cellules IPS indifférenciées fœtales avec les cellules I-P-S-R-P-E a révélé une régulation à la hausse dans 47 microARN et 36 ont été régulés à la baisse, tandis que les cellules EPR fœtales ont montré que 61 microARN étaient régulés à la hausse par rapport aux cellules I-P-S-R-P-E et 49 analyses de voies régulées à la baisse avec ingéniosité Le logiciel IPA a indiqué que les gènes cibles des microARN exprimés de manière différentielle étaient impliqués dans les processus cellulaires, y compris le développement cellulaire, la croissance et le cycle cellulaire. Cette analyse a également indiqué que les microARN exprimés dans les tissus oculaires in vivo étaient enrichis en I-P-S-R-P-E et en EPR fœtal par rapport aux cellules IPS. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’éviter la contamination et la dégradation des échantillons d’ARN à la suite de cette procédure.

D’autres méthodes telles que R-T-P-C-R peuvent être effectuées afin de confirmer le niveau d’expression des micro-ARN dans chaque type de cellule après son déploiement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur la vision pour explorer le rôle des micro-ARN dans la différenciation et la progression du cycle cellulaire dans la rrp. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dériver l’EPR à partir de l’EPP et de comparer le profil d’expression des microARN de l’I-P-S-R-P-E aux cellules IPS et à l’EPR fœtal.