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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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Sviluppo e riproduzione del topo da laboratorio

Overview

Il successo dell'allevamento del topo da laboratorio (Mus musculus) è fondamentale per la creazione e il mantenimento di una colonia animale produttiva. Inoltre, gli embrioni di topo sono spesso studiati per rispondere a domande sui processi di sviluppo. Ora esiste un'ampia varietà di strumenti genetici per regolare l'espressione genica durante lo sviluppo embrionale e postnatale del topo, che può aiutare gli scienziati a capire di più sulle malattie ereditarie che influenzano lo sviluppo umano.

Questo video fornisce un'introduzione alla riproduzione e allo sviluppo dei topi. Oltre a chiarire la terminologia utilizzata per descrivere la progressione dello sviluppo, la presentazione esamina le fasi chiave del ciclo di vita del mouse. In primo luogo, vengono descritti i principali eventi di sviluppo che si svolgono in utero, con particolare attenzione al layout unico dei primi embrioni di roditori. Successivamente, vengono forniti protocolli di allevamento per topi postnatali o cuccioli, incluso il processo di svezzamento o rimozione dei cuccioli dalla gabbia della madre. Poiché maschi e femmine devono essere separati in questa fase per prevenire l'accoppiamento non programmato, la dimostrazione rivela anche come determinare il sesso del topo. Successivamente, vengono fornite istruzioni per l'esecuzione di allevamenti di topi controllati, incluso lo screening per il tappo copulatorio, che è utile per lo sviluppo embrionale cronotemporato con precisione. Infine, il video evidenzia le strategie utilizzate per indagare i complessi processi che governano lo sviluppo dei topi, compresa la generazione di topi "knockout" geneticamente modificati.

Procedure

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I topi sono organismi modello estremamente preziosi che continuano a migliorare la nostra comprensione dello sviluppo umano e delle malattie. Tra i mammiferi, i topi hanno un'alta fecondità e un rapido sviluppo, il che significa che le colonie possono essere rapidamente espanse.

Poiché lo sviluppo all'interno dell'utero richiede alcune strutture embrionali specializzate, lo studio dell'embriogenesi in un modello di mammifero è anche più rilevante per gli esseri umani. In questo video, discuteremo le fasi di riproduzione e sviluppo del topo, come allevare topi e modi per applicare le conoscenze riproduttive e di sviluppo del topo in laboratorio.

Per prima cosa parliamo un po 'della riproduzione del mouse. Come gli esseri umani, lo sviluppo precoce del topo è interno, con la gestazione che si verifica all'interno delle corna uterine della madre, che viene chiamata "diga". Tuttavia, a differenza della maggior parte di noi, i topi trasportano molti feti contemporaneamente, producendo una dimensione media della cucciolata di 10 - 12 cuccioli in un periodo di gestazione.

Prima di discutere lo sviluppo di questi cuccioli in modo più dettagliato, esaminiamo i termini utilizzati per identificare le fasi di sviluppo. Il sistema di stadiazione più comune inizia al giorno zero embrionale, o E0, il giorno della copulazione riuscita. Successivamente, ogni fase è definita dal numero di giorni dalla fecondazione fino al giorno della nascita, quando la numerazione ricomincia al giorno zero postnatale o P0.

Poiché i tempi di sviluppo possono variare leggermente anche tra embrioni della stessa cucciolata, possono essere utilizzati anche approcci alternativi basati sulla morfologia piuttosto che sul tempo post fecondazione, come la stadiazione theiler.

Successivamente, diamo un'occhiata più da vicino ai cambiamenti morfologici che si verificano durante quelle prime settimane di sviluppo del topo.

Dopo la fecondazione dell'ovocita, l'embrione inizia la sua vita lentamente, completando solo 4 cicli di divisione cellulare nei suoi primi 3 giorni. Tuttavia, da E4 queste cellule si sono moltiplicate e riorganizzate per formare una palla compatta e cava di cellule nota come "blastocisti". In questa fase, le cellule che alla fine daranno origine all'embrione stesso si trovano tutte all'interno di un gruppo di cellule staminali noto come massa cellulare interna o ICM. Le cellule rimanenti, note come cellule del trofoblasto, diventeranno parte della placenta che fornisce ossigeno e nutrizione all'embrione.

Dopo questo punto, lo sviluppo dei roditori diventa un po 'contorto. Nella maggior parte dei mammiferi, le cellule che danno origine all'embrione formano una struttura simile a un disco. Al contrario, l'embrione di topo ha una configurazione a forma di coppa. Le cellule all'esterno di questa tazza formano uno strato cellulare noto come endoderma, che alla fine dà origine a tessuti profondi come il rivestimento del tratto digestivo. In modo confuso, le cellule sulla superficie interna della tazza rappresentano l'ectoderma, che forma tessuti più superficiali, come capelli e pelle.

Questo layout invertito persiste fino a circa il giorno embrionale 8, quando l'embrione si gira letteralmente. A questo punto, si sono sviluppate alcune altre strutture riconoscibili, compresi i somiti, che danno origine a tessuti come il muscolo scheletrico; e le gemme degli arti, che formeranno gli arti anteriori e posteriori.

Le cose si muovono abbastanza rapidamente da qui, con lo sviluppo dei principali sistemi di organi, come i polmoni e il tratto digestivo, ben in corso dal giorno embrionale 12. Sorprendentemente, gli embrioni sono pronti a sopravvivere al di fuori della madre dopo soli 19 -21 giorni di gestazione.

Ora che hai un'idea di come procede lo sviluppo in utero, parliamo di cosa succede dopo che i topi partoriscono. I topi appena nati, o cuccioli, sono piccoli, glari e ciechi.

Per le prime settimane di vita, i cuccioli possono ricevere nutrimento da qualsiasi femmina che allatta disponibile. Poi, circa tre settimane dopo la nascita, sono pronti per lo svezzamento, il che significa che è tempo di trasferirsi fuori dal posto della mamma in una gabbia tutta loro!

Per controllare l'allevamento futuro, dovrai separare i maschi e le femmine a questo punto. Per identificare i sessi, esaminare la distanza tra l'ano e i genitali esterni. Nelle femmine, questa distanza sarà più breve che nei maschi.

Per preparare la nuova casa dei cuccioli, fodera una gabbia con uno strato di biancheria da letto. Dal momento che si stanno ancora abitando ai nuovi scavi, aggiungi alcuni pellet di cibo ammorbiditi con acqua o un piatto di cibo umido sul fondo della gabbia oltre a fornire acqua.

I topi diventano sessualmente maturi entro poche settimane di svezzamento, con il loro picco di riproduzione che di solito cade tra i 2 ei 9 mesi di età.

Quindi, come usiamo queste informazioni per avviare una colonia riproduttiva? Innanzitutto, è importante ricordare che il comportamento di un topo è significativamente influenzato dal suo ritmo circadiano; dal momento che sono notturni, i tuoi topi si riprodurranno di notte.

Anche i feromoni svolgono un ruolo importante nel comportamento dei topi, quindi è utile "introdurre" potenziali compagni per farli conoscere. Per massimizzare il numero di cuccioli nati durante un ciclo riproduttivo, combinare un topo maschio con un massimo di 4 femmine.

Per cronodare con precisione lo sviluppo dell'embrione, tornare al mattino per controllare ogni topo femmina per un tappo di muco vaginale, che viene depositato dal maschio durante l'accoppiamento. I topi ovulano ogni 4 - 5 giorni; quindi se non vedi subito una spina, tieni insieme i topi per un'altra possibilità più tardi quella settimana. Una volta stabilito che alcune delle femmine sono incinte, rimuovi il topo maschio dalla gabbia, in quanto possono essere una minaccia per i cuccioli appena nati.

Al fine di studiare i complessi processi che controllano lo sviluppo degli embrioni di mammiferi, gli scienziati hanno sviluppato alcune tecniche molto interessanti. Diamo un'occhiata ad alcuni esempi.

Per iniziare, la mappatura del destino è un approccio in cui le cellule sono marcate e tracciate in vivo per determinare come contribuiscono a strutture specifiche nello sviluppo e nel tessuto adulto.

Qui, l'espressione di una proteina fluorescente viene attivata in una piccola popolazione di cellule per tracciare il contributo delle cellule che esprimono la proteina al tessuto cerebrale fetale e adulto.

Al fine di testare il ruolo di un gene specifico nello sviluppo, è utile esaminare l'esito della sua sovraespressione. In una tecnica chiamata elettroporazione in utero, il DNA viene consegnato all'embrione mediante microiniezione e quindi spinto nelle cellule applicando corrente elettrica attraverso il tessuto. Il risultato è l'induzione dell'espressione genica in cellule specifiche, come dimostrato dall'espressione della proteina fluorescente rossa nel sistema nervoso centrale di questo embrione.

Cambiamenti più permanenti nell'espressione genica si presentano sotto forma di topi knockout, in cui viene rimossa una porzione di un gene. Per generare questi topi, le cellule staminali vengono isolate dai primi embrioni e sottoposte a modifica del genoma. Le cellule modificate vengono trapiantate in una blastocisti, che viene poi impiantata in una femmina per la gestazione. Il cucciolo risultante sarà una "chimera" composta da cellule sia normali che knockdown e può essere allevato per generare topi knockout omozigoti.

Hai appena visto la panoramica di JoVE sulla riproduzione e lo sviluppo del mouse. In questo video abbiamo trattato la riproduzione dei topi, lo sviluppo prenatale e postnatale e come allevare i topi. Abbiamo anche discusso alcune interessanti applicazioni per lo studio dello sviluppo del mouse in laboratorio. Grazie per l'attenzione!

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