Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di esaminare gli effetti di un farmaco epigenetico su varie fasi della vita delle zanzare malariche. Ciò si ottiene sciogliendo il farmaco nell'habitat delle zanzare immature per determinarne gli effetti sulle larve, sulla sopravvivenza e sulle dimensioni corporee. Il farmaco viene anche aggiunto al sangue dei mammiferi e somministrato alle zanzare femmine adulte, che testeranno l'effetto del farmaco sulla riproduzione.

Infine, viene condotto un test enzimatico per testare l'inibizione dell'enzima zanzara da parte del farmaco. I risultati mostrano gli effetti dei cambiamenti epigenetici sulla sopravvivenza della zanzara malarica e per Conti, sulla base dell'analisi del biodosaggio, abbiamo avuto l'idea di questo protocollo. Quando veniamo a conoscenza dello sviluppo di un promettente farmaco epigenetico anti-cancro, questo farmaco induce la morte apoptotica nelle cellule tumorali umane come meccanismi per l'istomodificazione sono animali ormonali conservati, abbiamo una sorta di degustazione come un'app di effetto sulla zanzara della malaria.

Per iniziare, seleziona le larve di zanzara Novelis Gambi al secondo posto in stella e mettile su un tovagliolo di carta per due o tre secondi per rimuovere l'acqua in eccesso. Quindi aggiungere delicatamente 15 larve per pozzetto di una piastra di coltura cellulare priva di nucleasi a sei pozzetti contenente 10 litri di acqua distillata per pozzetto. Etichetta i pozzetti con nastri colorati per randomizzare l'esperimento.

Quindi etichettare due pozzetti per concentrazione di prova su ciascuna piastra. Successivamente, preparare una soluzione madre di deasy NEP cloridrato da un millimolare sciogliendo 0,3 milligrammi di deasy nep. In un millilitro di acqua distillata, aggiungere la soluzione madre di Z NEP cloridrato ai pozzetti etichettati per ottenere una concentrazione finale di 0,5 micromolari e 5,0 micromolari.

L'aggiunta della soluzione madre per le suddette concentrazioni non modificherà in modo significativo il volume dell'acqua nel pozzo. Tuttavia, in caso di concentrazioni molto più elevate, è consigliabile sciogliere il composto nel mezzo larvale per evitare qualsiasi diluizione non necessaria del composto. Dopo l'aggiunta del composto, nutrire e incubare le larve per 24 ore a 28 gradi Celsius.

Quindi registrare la mortalità per le zanzare larvali trattate con DZ NEP e non trattate. Ripetendo questa registrazione ogni giorno fino a quando tutte le larve muoiono o si impupano ed emergono. Da adulti, rimuovere e scartare le larve morte ogni giorno.

Inoltre, registrare le dimensioni delle larve ogni due giorni fino a quando non si preparano per eseguire il test di fecondità. Innanzitutto, assemblare il sistema di alimentazione artificiale che collega gli alimentatori e l'elemento riscaldante tramite i tubi. Una volta completato, accendi il sistema e seleziona SP one.

Premere invio per avviare il sistema. Monitorare la temperatura dell'acqua utilizzando un termometro digitale nell'impianto di riscaldamento. I connettori e i tubi aiutano a mantenere una circolazione costante dell'acqua attraverso il sistema, in modo che la temperatura del sangue rimanga.

A 37 gradi Celsius. Riempi un vassoio a fondo piatto con una soluzione di candeggina al 10% che verrà utilizzata per decontaminare eventuali fuoriuscite di sangue. Successivamente, aggiungere due millilitri di sangue di pecora defibrillato a una provetta per microcentrifuga ed etichettare come controllo.

Ripetere il processo per la provetta sperimentale etichettata come cinque micromolari DZ nep. Quindi aggiungere sei microlitri di soluzione madre DZ NEP alla provetta sperimentale etichettata con cinque micromolari DZ nep. Mescolare delicatamente il sangue e il farmaco capovolgendolo più volte prima di incubare la provetta per 10 minuti a temperatura ambiente.

Utilizzando una pipetta, aggiungere due millilitri di controllo e analizzare il sangue sulla parte superiore degli alimentatori etichettati in modo corrispondente. Gettare la pipetta nella soluzione di candeggina. Respira periodicamente l'aria sulla gabbia per incoraggiare le femmine a nutrirsi.

Copri la gabbia con un sacchetto scuro. Lascia che le zanzare si nutrano per circa 30 minuti. Una volta completata l'alimentazione, spegnere l'elemento riscaldante.

Estrarre gli alimentatori e rimuovere la pellicola di para dopo aver immerso l'alimentatore e la soluzione di candeggina per cinque minuti. Sciacquare bene in acqua deionizzata. Quindi, metti dei batuffoli di cotone con acqua zuccherata sulle gabbie per 48 ore.

Posizionare i piatti a base di uova etichettati con la rispettiva concentrazione di prova o di controllo che contengono acqua e carta da filtro nelle gabbie per una notte. Per facilitare la deposizione delle uova, rimuovere il piatto di uova il giorno successivo ed esaminare il numero e la struttura delle uova al microscopio stereoscopico. Ottenere immagini, contare il numero di uova e analizzare la differenza nel numero di uova ottenute da gabbie di prova e di controllo.

Questa parte del video mostra un saggio di attività enzimatica che utilizza DTNB come indicatore per determinare l'effetto di dz NEP sull'inibizione di SAH Hydro Lace nelle zanzare adulte. Per misurare l'inibizione di SAH Hydro Lace da parte di DZ nep, preparare l'estratto enzimatico accumulato di zanzare omogeneizzate 10 zanzare adulte non alimentate con sangue in un millilitro di fosfato di sodio monobasico molare 0,1 molare ghiacciato contenente lo 0,3% di tritton X 100. Utilizzando un omogeneizzatore di tessuti di vetro, trasferire l'omogeneizzato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Dopo aver centrifugato l'omogeneizzato per cinque minuti a 10.000 g e quattro gradi Celsius, trasferire il supinato in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Utilizzare il supinato come fonte enzimatica per il saggio biochimico SAH. Per il bianco, aggiungere 50 microlitri di SAH, 50 microlitri di DTNB e 100 microlitri di fosfato di sodio diba per ottenere una miscela master e aggiungere ai singoli pozzetti di una micropiastra a fondo piatto da 96 pozzetti.

Successivamente, per il controllo, aggiungere 50 microlitri di SAH, 50 microlitri di DTNB, 50 microlitri di fosfato di sodio diba e 50 microlitri di enzima idrolace SAH ai singoli pozzetti. Infine, per i trattamenti DZ NEP, aggiungere ai singoli pozzetti 50 microlitri di SAH, 50 microlitri di DTNB, 50 microlitri di enzima e 50 microlitri della concentrazione selezionata di DZ NEP. Prepararsi per le repliche per trattamento e controllo.

Leggere la densità ottica o OD dei campioni dell'enzima SAH a 405 nanometri per cinque minuti a intervalli di 22 utilizzando un lettore di micropiastre a 96 pozzetti. Infine sottrarre l'OD bianco dal controllo e dal trattamento ottenuto da ciascun pozzetto e calcolare la percentuale rimanente di attività idro SAH Utilizzando l'equazione trovata nel protocollo di testo, questi risultati dimostrano che il farmaco epigenetico DZ NEP sopprime la crescita e lo sviluppo e induce la mortalità nelle zanzare immature. La maggior parte delle zanzare esposte a 0,5 micromolari è morta entro il decimo giorno dell'esperimento, mentre un gran numero di zanzare esposte a cinque micromolari è morta entro l'ottavo giorno.

Al contrario, la mortalità delle zanzare nel trattamento di controllo è rimasta inalterata e molte sono emerse come adulte l'ottavo giorno dell'esperimento. L'effetto della DZ NEP sulla fecondità delle zanzare è illustrato qui. Le zanzare femmine adulte alimentate con sangue contenente DZ NEP hanno mostrato una significativa riduzione del numero di uova vitali rispetto al controllo.

Un gran numero di uova ottenute dalla gabbia di prova erano di colore più scuro e mancavano di galleggianti e assemblaggi simili a coccarde rispetto alle uova ottenute da zanzare femmine alimentate con sangue normale. L'assenza di galleggianti insieme a uova di colore più scuro indica il ruolo potenziale dell'epigenetica nella formazione dell'esocorion. Qui è dimostrato l'effetto di DZ NEP sull'attività dell'idrolace SAH nelle zanzare adulte della malaria maschi e femmine.

Per ogni trattamento farmacologico si osserva una diminuzione della OD dipendente da DZ NEP rispetto al trattamento di controllo, indicando che la dz NP inibisce l'attività dell'idrolace SAH dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei vettori per esplorare gli effetti dei farmaci epigenetici sulla zanzara della malaria.