化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

この手順の全体的な目標は、細胞集団内の金属の分布を画像化することです。これは、最初に滅菌窒化シリコーン窓を準備し、次にそれらの窓で細胞を成長させることによって達成されます。次に、細胞を固定し、適合する緩衝液にすすぎ、乾燥させます。

最後のステップは、ビームラインで細胞をイメージングすることです。最終的に、蛍光X線顕微鏡を使用して、細胞内の金属の分布を示します。一般的に、この方法に不慣れな人は、窓が非常に壊れやすいため、苦労するでしょう。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、最小限の細胞凝集で窓上で細胞を増殖させるだけでなく、細胞がX線蛍光基質にうまく接着しないため、すすぎステップが難しいため、非常に重要です。最初のタスクは、ウィンドウを分離することです。まず、ステレオスコープを使用して、逆の細い先端ピンセットのペアがまっすぐに整列し、きれいであることを確認します。

次に、窓の入ったカプセルを少し開けます。ウィンドウを含む一方の端を握り、もう一方の端を回転させます。窓自体を絞らないでください。

次に、ピンセットでフレームを慎重につかみながら、開いた端の近くでカプセルをそっと絞ります。圧力をかけて、窓の端が出てくるカプセルの幅を広げ、窓を取り外してください。次に、粘着テープを準備します。

きれいなスライドにテープを置き、スライドの長辺から4分の1インチのテープを切り取ります。次に、テープのスライドを短辺に置き、ピンセットでテープの一部を取り外します。テープを窓の端に貼り付け、窓の開口部をテープで覆わないように注意しながら、窓の端に貼り付けます。

ピンセットを使って、窓を培養皿の底にセットし、テープを皿にしっかりと押し付けます。次に、このプロセスを繰り返して、ウィンドウの反対側をテープで留めます。これで、皿をUVで1時間滅菌する必要があります。

このプロトコルでは、添付されたウィンドウを含む皿上で細胞を50〜70%のコンフルエンスまで増殖させる必要があります。バイタルステインが適用され、細胞を画像化してから、固定を進める必要があります。皿を45度の角度で静かに傾けて、穏やかに吸引してメディアを取り除きます。

次に、DPBSで皿をやさしくすすいでください。新鮮な4%PFA-PBSを45度の角度で皿の側面に向かってゆっくりと追加することにより、取り除いた液体をすぐに交換します。ゆっくりと角度を緩めて、固定液が窓を覆うようにします。

固定後20分間、固定剤を細胞に保持します。穏やかな吸引で液体を取り除きます。以前と同じ穏やかなテクニックを使用して、液体をパイプにそっと置き換えます。

ショ糖溶液。細胞が基質にうまく接着しないため、液体を除去して交換する技術は重要です。これは、多くの初めてのタイマーが実験が失敗した場所です。

その後、パイプスクロース溶液を静かに交換して、残留固定剤を洗い流します。次に、テープをピンセットでつまんでウィンドウを取り外します。窓がテープから外れた場合は、溶液を加えて窓を表面に浮かせ、逆ピンセットで窓を取り外してください。

次に、窓に触れずに、端から解決策を徹底的に注ぎます。また、組織の丸い折り目を使用して、へこんだ領域をドブします。目標は、窓に塩やバッファーが結晶化しないようにすることです。

最後に、マットの尾根に対して端に支えられたグリッドマットに窓を慎重に置きます。窓はマットにできるだけ触れないようにする必要があります。サンプルが乾燥したら、光学顕微鏡を使用して窓に細胞が存在することを確認します。

窓に細胞が付着していることを確認したら、窓を梱包して放射光ビームラインに輸送します。窓の両端をスライドガラスにそっとテープで固定します。次に、スライドガラスをプラスチック製のペトリ皿にテープで固定し、ペトリ皿をテープで閉じます。

この時点までは、一般的な研究室で実施することができ、以下の段階ではシンクロトロンビームラインで行うのが最適です。窓の開梱は、ピンセットでテープをそっと剥がすことから始まります。その後、窓はシンクロトロンのビームライン協力者が提供するアルミニウムホルダーに移されます。

窓の端に沿って薄く均一なマニキュアを塗って窓を固定します。次に、アルミホルダーをキネマティックマウントに挿入します。マウントは、サンプルチャンバー内とX線顕微鏡のビームラインにある電動ステージに接続されたブラケットに取り付けます。

リードラインを出てX線顕微鏡装置エリアに移動した後、ビームライン専用のソフトウェアを使用してスキャンを設定します。サンプル上のX線ビームの位置を見ながらスキャンするサンプルの適切な領域を選択します。ビデオクロスヘアを装備し、ダウンストリームシンチレータカメラと事前に位置合わせされたカメラを使用して、テキストプロトコルで追加の詳細が提供されます。

サンプルのX線画像でこれらの技術を使用すると、このヒトHSY five Y細胞のように、固定が細胞のこれらの側面を保持することを示す、存在する要素にばらつきがあることを確認できます。しかし、乾燥中にバッファーが存在したままの場合、広範な結晶形成により細胞に構造的な損傷が生じ、X線蛍光スペクトルの収集が妨げられます。これは、処理が不十分なRET B 1 0 3セルで見られます。

このビデオを見れば、蛍光X線イメージングのための化学固定による接着細胞の調製方法について十分に理解できるはずです。ホルムアルデヒドや生物学的物質の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切なPPEや施設のガイドラインに従うなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。