Bir Balık-besleme Laboratuvar biyodeneyinde Deniz Organizmaların Dokular Sekonder Metabolitlerin Antipredatory Aktivite değerlendirmek için

Bu prosedürün genel amacı, deniz organizmalarının dokularından ikincil metabolitlerin anti predatör aktivitesini değerlendirmektir. Merhaba, ben North Carolina Wilmington Üniversitesi'nden Dr. Joseph Pollock ve deniz organizmalarının dokularında kimyasal savunmayı test etmek için biyo-tahliller gerçekleştirme konusunda bu videoyu bir araya getiren ekip lideri olan yüksek lisans öğrencisi Michael Marty bana katıldı. 1980'lerin sonlarında görmek üzere olduğunuz yöntemleri geliştirmeye başladık.

O zamanlar, doğal ürünler kimyagerleri, herhangi bir deneysel kanıt olmaksızın ikincil metabolitlere ekolojik roller veriyorlardı. Bu arada, ekolojistler, ekolojik ilgisi olmayan toksisite testlerinden savunma rollerini tahmin ediyorlardı. Burada, deniz organizmalarının dokularından ikincil metabolitlerin anti yırtıcı aktivitesini değerlendirmek için tasarlanmış bir yaklaşım sunuyoruz.

Bu yaklaşım, biyolojik tahlillerin beslenmesi için dört önemli kriteri karşılamaktadır. Birincisi, uygun bir genelci avcı kullanıyoruz. İkincisi, dokulardan tüm polaritelerin organik metabolitlerini kapsamlı bir şekilde çıkarıyoruz.

Üçüncüsü, bu metabolitleri organizmada bulunanla aynı hacimsel konsantrasyonda deneysel bir yiyeceğe koyduk. Ve dördüncüsü, deneysel tasarımımız ve istatistiksel yaklaşımımız, göreceli tatsızlığı belirtmek için anlamlı bir ölçüm sağlar. Bu besleme deneylerinde, Karayip deniz omurgasızlarından alınan dokuları kullanarak tahliller için uygun bir model yırtıcı balık olan fossumun mavi başlı thoma'sını kullanıyoruz, çünkü bu balık türü Karayip mercan resiflerinde yaygındır ve çok çeşitli bentik omurgasızları örneklediği bilinmektedir.

Şimdi Michael protokolü ayrıntılı olarak açıklayacak. İlk olarak, doku çıkarılmalıdır. Dereceli bir santrifüj tüpüne 30 mililitrelik bir nihai hacme kadar bire bir diklorür, metan ve metanol karışımı ekleyin.

Daha sonra hedef organizmanızdan doku parçaları kesin. Bu taze veya donmuş doku ile yapılabilir. Süngerlerle çalışıyoruz, bu yüzden bu film gösteriminde turuncu fil kulağı süngeri, alus, plet roadies yer alacak.

Hacmi doğru elde etmek için çok küçük doku parçaları kesmeniz gerekebilir. Hacimsel yer değiştirmeyi kullanarak, tam olarak 10 mililitre doku çıkarabilir, tüpü kapatabilir ve ters çevirebilir, daha sonra bu süre zarfında dört saat çalkalayabilirsiniz, su metanol ile birleşir ve elde edilen metanol su fazı di kloro metan fazından ayrılır. Tüpler çalkalanırken doku dönüşümlü olarak her bir ekstraksiyon ortamına maruz bırakılır.

Bu ekstraksiyon döneminden sonra, iki farklı faz belirgin olacaktır. Metanol ve suyun polar fazı, bir pasör pipet transferi kullanılarak kloro metanın polar olmayan fazının üzerine oturacaktır. Dereceli santrifüj tüpünden yuvarlak tabanlı bir şişeye di kloro metan özütütü, dereceli santrifüj tüpü buzdolabında saklanmalıdır.

Sonraki birkaç adım için, döner buharlaştırıcıdaki tüm adımlar için yuvarlak tabanlı şişeyi bir döner buharlaştırıcıya takın. Su banyosunun sıcaklığının 40 santigrat derecenin altında kaldığından emin olun. Döner evaporatör için temel çalıştırma prosedürlerini takiben, di kloro metanı yuvarlak tabanlı şişede kurutun, çok az miktarda di kloro metan kullanarak kurutulmuş polar olmayan özü yeniden süspanse edin.

Yuvarlak tabanlı şişenin kenarlarından kurumuş malzemeyi çıkarmak için biraz çalkalama veya döndürme yardımcı olabilir. Daha sonra kloro metan ekstraktını yuvarlak tabanlı şişeden 20 mililitrelik bir parıldama şişesine aktarın. Kapağı parıldama şişesine yerleştirmek yerine, sintilasyon şişesine bir döner buharlaştırıcı adaptörü takın ve tekrar kuruyana kadar buharlaştırın Döner bir buharlaştırıcıda, kurutulmuş polar olmayan ekstrakt içeren parıldama şişesi, sonraki birkaç adımda buzdolabında saklanabilir.

Doku ve metanol su ekstraktını içeren dereceli santrifüj tüpüne geri dönersek, ekstraksiyon ortamını sıkıştırma yoluyla dokudan sıkıştıran, dokuyu sıkıştıran ev yapımı bir alet kullanacağız. Daha sonra metanol su ekstraktını yuvarlak tabanlı şişeye aktarın ve buzdolabında soğutulmuş olarak saklayın. Doku iki ila altı saatlik ikinci bir ekstraksiyon için suya batırılana kadar dereceli santrifüj tüpüne metanol ekleyin.

İkinci metanol ekstraksiyonu tamamlandıktan sonra, soğutulmuş yuvarlak tabanlı şişeyi buzdolabından çıkarın, dereceli santrifüj tüpünün içeriğini sıkıştırın ve bu yeni metanol özütünü, daha önceki metanol su ekstraktını içeren orijinal yuvarlak tabanlı şişeye aktarın. Bu noktada, dokunun tam olarak çıkarılmadığına dair herhangi bir endişe varsa, iki ila altı saatlik metanol ekstraksiyon adımı tekrarlanabilir. Yuvarlak tabanlı şişeyi döner bir buharlaştırıcıya takın ve metanolü daha önce olduğu gibi kurutun.

Su banyosunun sıcaklığını 40 santigrat derecenin altında tutmayı unutmayın. Yuvarlak tabanlı şişe, 20 mililitrelik parıldama şişesindeki kurutulmuş polar olmayan ekstrakt ile birleştirilmesi gereken sulu bir ekstrakt içerecektir. Bu nedenle, yuvarlak tabanlı şişenin içeriğini 20 mililitrelik sintilasyon şişesine aktarın.

Gerekirse, kalan ekstraktın tamamını toplamak için yuvarlak tabanlı şişeyi az miktarda metanol ile durulayın. Parıldama şişesi şimdi kurutulmuş polar olmayan ekstraktı ve polar ekstraktı içerir. Bununla birlikte, polar ekstrakt küçük bir hacimde sıvı içinde süspanse edilir.

Düşük ısıda bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak, sulu ekstraktı kuruyana kadar buharlaştırın. Parıldama şişesi şimdi 10 mililitre dokudan oluşan kuru, ham bir organik ekstrakt içerir, şişeyi boya nitrojen gazı ile üfler ve dondurucuda eksi 20 santigrat derecede saklanır. Bu doku ekstraktlarının lezzetini test etmek için, önce hedef organizma ile besinsel olarak karşılaştırılabilir bir gıda matrisinde yeniden oluşturulmaları gerekir.

Kalamar manto halkaları, omurgasız dokularının biyolojik tahlilleri için uygun bir protein kaynağıdır ve liyofilize bir toz halinde kolayca hazırlanabilir. Bu biyo-tahlilin başlaması için donmuş kalamar manto halkalarını ılık deiyonize suya yerleştirin. Çözüldükten sonra suyun bir kısmını boşaltın ve halkaları bir karıştırıcıya dökün.

Kalamar manto viskoz bir sıvı haline gelene kadar yüksekte iyice karıştırın. Malzeme karışamayacak kadar kalınsa Su ekleyin. Sığ bir kurabiye tepsisine ince bir tabaka sıvılaştırılmış kalamar manto dökün ve eşit şekilde yayın.

Çerez tabakasını eksi 20 santigrat derecede bir dondurucuya koyun. Liyofilizasyon işlemini kolaylaştırmak için donmuş kalamar tabakası daha küçük parçalara ayrılmalıdır. Daha küçük parçalar daha iyidir çünkü daha hızlı kururlar.

Dondurarak kurutucuda. Kırık donmuş kalamar parçalarını hazneye yerleştirin ve dondurarak kurutma makinesinin çalıştırma prosedürlerini izleyin. Liyofilize edildikten sonra kalamar parçaları toz haline getirilmelidir.

Bu bir blender ile gerçekleştirilebilir. Kurutulmuş kalamar parçalarını karıştırıcıya yerleştirin ve malzeme düzgün bir Toz olarak görünene kadar yüksekte çalıştırın. Bir sonraki adım, partikül kalamar tozunun solunmasını azaltmak için bir çeker ocakta yapılmalıdır.

Dondurularak kurutulmuş kalamar tozunu döner bir çiçek eleğine dökün. Elekten geçen tozu yakalamak için eleğin altına bir kap tutun. Dondurularak kurutulmuş kalamar malzemesini elemek için krankı döndürün.

Önceki adımlarda yeterince karıştırılmamış olan büyük bağ dokusu iplikleri, gerekirse bir huni kullanılarak daha ince bir toz elde edilerek elekte tutulacak, dondurularak kurutulmuş kalamar tozunu sızdırmaz bir kaba aktaracak, boya nitrojen gazı ile üfleyecek ve donmuş olarak eksi 20 santigrat derecede saklanacaktır. Dondurularak kurutulmuş kalamar manto tozunu hazırladıktan sonra, artık tahlil gıda karışımından bir parti yapmaya hazırız. Aynı gün içinde birden fazla ardışık tahlil yaparken, gıda karışımından büyük bir parti yapmak pratiktir.

Burada, üç gram aljinik asit ve beş gram dondurularak kurutulmuş kalamar manto tozu içeren temiz bir peynir altı suyu teknesi kütlesi kullanarak 100 mililitre hacimli bir karışım için hazırlık sürecini gösteriyoruz. Su eklemeden önce bu kuru malzemeleri 150 mililitrelik bir behere koyun. Kuru malzemeleri karıştırmaya yardımcı olmak için bir mikro spatula ile hafifçe karıştırın.

100 mililitre deiyonize su ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. Tozun tamamen nemlendirilmesi birkaç dakika sürebilir. Bu adımı geçmeden önce homojen bir karışıma sahip olduğunuzdan emin olun.

Gıda matrisini tutarlı bir renge boyamayı seçerseniz, bu adımda renk boyasını ekleyin. Tam olarak 10 mililitre yiyecek karışımı ile dereceli bir şırınga yükleyin. Bu adımda, hacimsel hassasiyet çok önemlidir, bu nedenle hava kabarcıklarının dahil edilmesini önlemek için çok dikkatli olun.

Kuru ham organik ekstrakt içeren 20 mililitrelik sintilasyon şişesini dondurucudan çıkarın ve bir veya iki damla metanol ekleyin. Çok fazla metanol eklemeyin. Bu, gıda matrisinin kurulmasını önleyecektir.

Bir mikro spatula ve minimum çözücü kullanarak, ekstraktı homojen bir karışıma yeniden süspanse edin. Tüm ekstraktın yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için şişenin kenarlarını kazıdığınızdan emin olun. 10 mililitre gıda matrisi içeren şırıngayı, yeniden süspanse edilmiş homojenize ekstrakt içeren 20 mililitrelik sintilasyon şişesine çıkarın.

Bu karışımı mikro spatula ile homojen olana kadar karıştırın. Ekstrakt karışımından çok küçük bir hacim yükleyin. Bir şırınga için bir mililitre bol miktarda bulunur.

Şırınga ucunu 0.25 molar kalsiyum klorür çözeltisine batırın ve uzun bir spagetti benzeri iplik oluşturmak için şırınganın içeriğini çıkarın. İplik bu çözeltide sertleşecektir. Birkaç dakika sonra sertleşmiş ipliği çıkarın ve bir cam kesme tahtası üzerine koyun.

İpliği dört milimetre uzunluğunda topaklar halinde kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Ekstraktla işlenmiş peletleri toplayın ve deniz suyunda durulayın. Kontrol peletlerini hazırlamak için.

Herhangi bir doku özütü eklemeden aynı prosedürü izleyin. Kontrol ve işlenmiş peletlerin rengini eşleştirmek için gıda boyası ilavesi gerekli olabilir. Balıkların kesinlikle yemeyi reddedeceği olumsuz bir kontrol hazırlamak için.

Miller ve Pollock tarafından tarif edildiği gibi çiğ gıda karışımına mililitre başına iki miligram konsantrasyonda deton ve benzoat tozu ekleyin. 2013, Besleme tahlilleri yapıldı Yabani yakalanan sarı faz mavi kafa RA'ları ile fum balıkları tarafından thala, laboratuvar akvaryumunun opak kenarlı bölmelerinde üçlü gruplar halinde tutulur. Gıda peletlerinin teslimi için uygun bir kap, lastik ampullü bir cam pipettir.

Balık tarafından kolayca tüketilirse bir pelet kabul edilmiş olarak kabul edilir. Bir pelet, bir veya daha fazla balık tarafından ağız boşluğuna almak için en az üç denemeden sonra yenmezse reddedilmiş olarak kabul edilir. Ya da böyle bir denemeden sonra pelete yaklaşılır ve göz ardı edilirse.

Kontrol peletlerini yemeyi reddeden işbirliği yapmayan balık grupları tahlillerde dikkate alınmamalıdır. Bu akış şeması, her durumda tahlil prosedürünün, balık grubunun işbirlikçi olduğunu doğrulamak için bir kontrol peleti ile başladığını göstermektedir. İşlenmiş bir pelet sunun.

Balıklar işlenmiş peleti kabul ederse, bu numune kabul edilmiş olarak puanlanır. Balıklar işlenmiş peleti reddederse, balığın beslenmeyi bırakıp bırakmadığını doğrulamak için müteakip bir kontrol sunulmalıdır. Balık sonraki kontrol peletini kabul ederse, numune reddedildi olarak puanlanır.

Her numune 10 bağımsız balık grubu ile çalıştırılmalıdır. İşte bu besleme testinin bir örnek çalışması. İlk olarak, balıkların kontrol peletini kabul etmesi için bir kontrol peleti sunulur.

İkinci olarak, işlenmiş bir pelet sunulur. Bu durumda, balıklar işlenmiş peleti reddeder. Bu nedenle, müteakip bir kontrol peleti sunulmalıdır.

Balıklar sonraki kontrolü kabul eder ve numune reddedilmiş olarak puanlanabilir. Her numune 10 bağımsız balık grubu ile çalıştırılmalıdır. Kontrol ve işlenmiş peletlerin tüketimindeki farklılıkların önemi, Low ve Pollock 2014 tarafından sunulduğu gibi, fisher'ın kesin testinin değiştirilmiş bir versiyonu ile değerlendirilmelidir.

Test, kontrol ve işlenmiş peletler için marjinal toplamlar sabitlenecek şekilde değiştirilir ve her ikisi de rastgele numuneler olarak muamele edilir. Bu, yedi pelet yenildiğinde 0.057'ye eşit bir P değeri sağlar. Bu nedenle, altı veya daha az pelet yenirse ve lezzetli olursa herhangi bir ekstrakt caydırıcı olarak kabul edilir.

Yedi veya daha fazla pelet yenirse. Ekstrakt grupları arasındaki lezzeti karşılaştırırken, temsili sonuçlarda gösterileceği gibi yenen ortalama pelet sayısı kullanılmalıdır. Burada, altı yaygın Karayip süngeri türü için bu biyolojik tahlilin sonuçlarını rapor ediyoruz.

Bu veriler ilk olarak Pollock ve arkadaşları tarafından 1995 yılında yayınlanmıştır ve bu yaklaşımın, birlikte ortaya çıkan taksonlar arasındaki kimyasal savunma stratejilerindeki farklılıkları aydınlatmadaki gücünü göstermektedir. Y eksenindeki her kategori, tek bir sünger türünden elde edilen özleri temsil eder. Her türün birkaç bireyi örneklendi, ekstrakte edildi ve test edildi, tür adından sonra parantez içindeki sayı ile gösterildi.

Sonuçlar, yenen ortalama gıda peleti sayısı ve her tür için standart hata olarak rapor edilir. Alus, pleth, pheon, kompresör ve foris adı verilen lycine'den elde edilen ham organik ekstrakt ile yapılan tahlillerde neredeyse hiç pelet yenmedi. Buna karşılık, Vais'in Cali süngerimsi'nden elde edilen ekstrakt ile yapılan peletler.

Geo Osa ve Michel lavis tahlilde kolayca tüketildi. İlk üç tür için altıdan az pelet yenildi, bu nedenle önemli ölçüde caydırıcı olarak kabul edilebilirler. Buna karşılık, ikinci üç tür kontrollerden önemli ölçüde farklı değildi ve lezzetli olarak kabul edilebilirler.

Az önce gösterilen yöntemler, manipülatif alan deneyleri ve anketleri ile birlikte anti-yırtıcı kimyasal savunmaları incelemek için güçlü bir yaklaşım sunmaktadır. Bu biyo-tahlillerin sonuçları, araştırma grubumun Karayip mercan resiflerindeki deniz omurgasızlarının dağılımını ve bolluğunu kontrol eden faktörleri anlamasına yardımcı oldu. Daha da önemlisi, bu yöntem, kimyasal ekolojinin ötesinde kimyasal ekolojide ekolojik alaka ihtiyacını karşılar.

Bu biyo-tahlillerin sonuçları, farmakoloji, biyoteknoloji ve evrimsel ekoloji dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarındaki araştırmaları bilgilendirebilir.