Transformación biolística de un fluorescente Tagged gen en el oportunista por hongos patógenos Cryptococcus neoformans

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una demostración paso a paso de la transformación biótica de una construcción lineal que contiene una etiqueta fluorescente. Esto se logra recubriendo primero las cuentas de oro de los microcoches con el ADN de interés. En el segundo paso, el ADN se transfiere a las células C neo forina mediante una pistola de genes.

A continuación, se colocan las células transformadas en placas y se evalúa la integración de la construcción de ADN mediante PCR y R-T-P-C-R. En última instancia, la microscopía fluorescente se utiliza para confirmar la integración adecuada del producto de ADN a través de la recombinación homóloga. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la electroporación, es que la transformación BIC da como resultado una integración estable en el genoma de la criptooficina.

Casi rendimiento. Quien demuestra esta técnica es Tanya Taylor, una estudiante de doctorado en mi laboratorio que se ha vuelto experta en esta técnica. Comience usando pinzas para sumergir los discos BIC macroportadores de naranja en etanol al 100%, luego transfiera los discos a una placa de Petri grande que contenga un secador, teniendo cuidado de que los discos no toquen el desecante.

Una vez secos, presione los discos en soportes de discos de plata limpiados con etanol, luego agite un tubo de cuentas de oro y alícuota de 12 microlitros de la solución de perlas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por transformación. A continuación, secuencialmente, agregue dos microgramos de ADN, 10 microlitros de cloruro de calcio y dos microlitros de base libre de esperma en cada tubo de perlas. Vórtice cada muestra.

A continuación, incubar los tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos con movimientos suaves ocasionales para resus. Suspenda las perlas sedimentadas al final de la bolita de incubación, las perlas de oro recubiertas de ADN y aspire cuidadosamente el snat. Vuelva a suspender lentamente las perlas por completo en 600 microlitros de etanol al 100%, luego vuelva a pelar las células.

Esta vez resus suspendiendo las perlas en ocho microlitros de etanol. Ahora dispense cada tubo de cuentas en el centro de un disco BIC individual en círculos de un centímetro de diámetro. Si hay una concentración suficiente de cuentas, se verá un círculo dorado en el centro de cada disco.

Una vez que las perlas estén secas, para operar la pistola de genes, primero encienda la bomba de vacío, luego gire la perilla del tanque de helio en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que se alcance una presión de aproximadamente 2200 PSI en el manómetro. A continuación, accione el interruptor rojo izquierdo para encender la pistola genética y ajustar los caudales de la aspiradora y la ventilación para que la aspiradora alcance las 28 pulgadas de mercurio en 15 segundos. Confirme que la distancia entre el disco de ruptura y el portador macro es de aproximadamente tres octavos de pulgada en este momento también.

Cuando todo esté en su posición, limpie toda la cámara con etanol al 70% y sumerja los discos de ruptura en etanol al 100%. Después de secar los discos sobre una superficie estéril, utilice una llave dinamométrica para aflojar el soporte del disco de ruptura e inserte un disco limpio. Vuelva a atornillar el soporte del disco de ruptura en su lugar y gírelo una vez hacia la derecha con la llave dinamométrica para apretarlo.

A continuación, sumerja las pantallas de malla en etanol al 100%. Una vez seco, coloque una pantalla en la placa de montaje de plástico blanco y coloque el soporte del disco portador macro con el lado DNA hacia abajo en la cámara del disco, atornille en la tapa plateada y coloque la placa de montaje en la ranura más alta. A continuación, coloque una placa de barrena YPD que contenga un molar de sorbitol en la placa inferior.

Ahora cierre la puerta de la cámara y asegúrela en su lugar. Luego, presione y mantenga presionado el interruptor rojo central en la posición hacia arriba para activar la aspiradora y permitir que alcance 28 pulgadas de mercurio. Una vez que se alcance el nivel de vacío adecuado y el interruptor central se haya movido a la posición hacia abajo, mantenga presionado el interruptor rojo derecho para disparar.

Cuando el disco de ruptura explote, suelte inmediatamente el botón de disparo y empuje el interruptor rojo central a la posición central. Para ventilar la cámara a cero PSI si el disparo fue exitoso, se verá un anillo de oro en la placa. Limpie el disco de ruptura y los restos del disco portador macro y apague la pistola de genes.

Luego gire la perilla del tanque de helio en el sentido de las agujas del reloj para apagar el gas y apagar la bomba de vacío. Después de un período de descanso de cuatro horas, agregue 700 microlitros de YPD a cada plato. A continuación, utilice un raspador de células para levantar suavemente las células de la barrena y transferir la suspensión de células a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros.

Después de un segundo lavado YPD para recuperar todas las células, gírelas hacia abajo y vuelva a suspender el pellet. En 500 microlitros de YPD, luego dispense 100 microlitros de la suspensión celular en el centro de las placas de antibiótico YPD más y extienda las células con perlas de vidrio. Finalmente, incube las placas boca abajo a temperatura ambiente durante tres o cuatro días.

A medida que aparezcan las colonias, colóquelas en nuevas placas de antibióticos YPD plus. Tanto el ADN como el ARN pueden aislarse de las colonias individuales de c neoformans y analizarse para confirmar una correcta integración y expresión de los constructos. Por ejemplo, si este protocolo se utiliza para la marca, la PCR de fusión génica se llevaría a cabo utilizando un conjunto de cebadores en el que un cebador y neos hacia el exterior de la construcción y dentro del genoma circundante para confirmar la recombinación correcta en el locus deseado.

Los carriles uno y dos son productos PCR obtenidos. Utilizando este conjunto de cebadores con ADN genómico de neoformans H 99 de tipo C silvestre y la cepa transformada de cereza A CKM, se utilizaría R-T-P-C-R para confirmar que tanto el gen de interés como la etiqueta se expresan. En efecto. Este producto de fusión R-T-P-C-R indica que la etiqueta se fusionó correctamente con el gen a nivel de ARN.

A continuación, se puede utilizar la microscopía fluorescente para confirmar que la recombinación en el locus deseado fue exitosa y que el ARN se tradujo a la proteína de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar una pistola Jing balística y usarla para la integración homóloga exitosa de una construcción lineal en el genoma de cryptococcus. Neo formm.