Transformación de Genómica de la Picoeukaryote Ostreococcus tauri

El objetivo general de este procedimiento es generar y seleccionar líneas trenchgénicas estables del nuevo organismo modelo, Austria Occus Tori, una especie de lgal pico eucariota marino. Esto se logra generando primero gránulos celulares a partir de 50 mililitros de cultivo denso de ALG por transformación. El segundo paso es mezclar las células con ADN linealizado y luego realizar la electroporación.

Después de diluir las células transformadas en fresco, medio e incubar durante la noche, agregue aase al 0,2% de punto de fusión bajo y un agente selectivo, y vierta la mezcla en pequeñas placas de Petri. El paso final es elegir las colonias resultantes que habrán crecido después de dos o tres semanas de incubación con luz azul constante. En última instancia, la selección en líquido, medio y análisis moleculares posteriores, como PCR y Southern blot, se utilizan para mostrar la integración exitosa del constructo en el genoma de las líneas transgénicas generadas.

La principal ventaja de utilizar este organismo sobre los organismos modelo existentes como Arabidopsis es que reduce en gran medida la complejidad genómica que permite el estudio de redes reguladoras en segundo plano sin prácticamente redundancia genética. Aunque en mi laboratorio hemos utilizado osteo occus para estudiar el reloj circadiano de las plantas, se puede utilizar para estudiar muchas otras redes celulares complejas. Por lo tanto, las implicaciones de esta técnica se extienden mucho más allá del ámbito de la biología vegetal.

La demostración visual de este método es fundamental porque, aunque los pasos individuales parecen bastante simples, el manejo adecuado de las celdas y un flujo de trabajo eficiente son esenciales para obtener un buen resultado. Partes de este procedimiento serán demostradas por Culin Kish, un asistente de investigación de un laboratorio. Las células de Austria Occus se cultivan en agua de mar artificial o en un SW para preparar una SW que se disuelve en 40 gramos por litro.

Sales marinas en agua desionizada a una salinidad de 30 partes por mil o PPT según se mide. Usando un medidor de salinidad, agregue enriquecimiento, oligoelementos metálicos medios y vitaminas, y luego filtre esterilizado a través de células brutas de filtro de 0,22 micras de la cepa de coco de Austria O TT H 95 en un SW bajo luz constante. En una incubadora de crecimiento de plantas equipada con un filtro azul claro de luna, la intensidad de la luz debe estar cerca de 20 micromoles por metro cuadrado por segundo, y la temperatura mantenida a 20 grados centígrados, las células no requieren agitación constante, sino que se agitan una vez cada dos o tres días para evitar la agregación.

Para el mantenimiento, subcultive las células asépticamente a una dilución de uno a 100 en fresco un SW cada siete días. Cada transformación requiere 50 mililitros de células a una densidad de células de 20 a 30 veces 10 elevado a las seis células por mililitro. Esta densidad debe alcanzarse de cinco a siete días después del subcultivo.

La densidad celular aproximada y el eje se pueden estimar en un hemocitómetro un mínimo de 40 veces. La magnificación o preferentemente se determinará por citometría de flujo. Aquí se muestra un ejemplo de culturas saludables frente a culturas no saludables.

Cada gráfico bioparamétrico muestra la dispersión lateral o SSC en el eje y frente a la fluorescencia roja por célula o FL tres en el eje x. FL tres representa la fluorescencia roja de clorofila, y SSC es indicativo del tamaño relativo de la célula. Las células sanas caen en la ventana de Austria Occus, mientras que las células moribundas o las bacterias contaminantes caen fuera de esta ventana.

Lo ideal es que más del 99% de las células estén en la ventana Austria Occus. Para una transformación genética eficiente, cada transformación requiere cinco microgramos de plásmido linealizado puro, ADN como una concentración de un microgramo por microlitro. En agua desionizada estéril, el plásmido ha sido linealizado por una enzima que corta en la columna vertebral del vector utilizado, pero no en el gen transgénico o de selección.

Mantenga el tubo de microcentrífuga que contiene el ADN en hielo junto con una veta de electroporación de dos milímetros para cada transformación. Es necesario un control sin ADN para que cada línea celular se transforme. Para cada transformación, transfiera 50 mililitros de células a un tubo con un fondo cónico, agregue ácido mónico al 0,1% F 68 y centrifugue durante 10 minutos a 8.000 veces G a 10 grados Celsius.

Para pellet las células, deseche inmediatamente el suptante y agregue un mililitro de tampón de suspensión Resus a las celdas. Resus suspende las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo, transfiere a un tubo de microrresiduos y gira hacia abajo durante 10 minutos a 8.000 veces. G a 10 grados centígrados trabajando rápidamente lavar las células una vez más después del segundo centrifugado.

Corta una punta P 200 para resuspender cada pellet en 40 microlitros de suspensión Resus. Tampón a 40 microlitros de las células resuspendidas en cada tubo de ADN linealizado en hielo. Mezcle suavemente y transfiera a la veta de electroporación.

Coloque el veta en la máquina de electroporación. Ajuste la configuración a seis kilovoltios por sensor recíproco, 600 ohmios y 25 micro días. Electro operar las celdas después de la electroporación.

Incubar las células de las cubetas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Durante este tiempo, etiquete los matraces de cultivo de tejidos y agregue 30 mililitros de SW fresco a cada matraz. Tome un mililitro de SW de cada matraz y agréguelo suavemente a la incubación de vete correspondiente durante dos minutos.

A continuación, retire suavemente el SW que ahora contiene el glo de células y acaricie suave y lentamente directamente el SW.In las células del matraz de cultivo normalmente permanecerán en un Glo grande. Tenga cuidado de no sacudir o perturbar las células agregadas en este momento. Deje que las células se recuperen en la incubadora durante una o dos horas.

Finalmente, vuelva a suspender las células agitando manualmente el matraz. En este punto, las células deben resuspenderse libremente y no deben verse grumos. Deje que los cultivos se recuperen durante la noche en la incubadora al día siguiente de la electroporación en autoclave, una solución de haase de bajo punto de fusión al 2,1% en agua bidestilada en una botella que contenga una varilla de estrella.

Manténgalo fundido a una temperatura de 65 a 90 grados centígrados en un vaso de precipitados más grande que contenga agua en una estrella magnética de calentamiento. Para cada transformación, prepare ocho placas de Petri de 50 milímetros y ocho tubos de 50 mililitros que contengan cada uno nueve mililitros de un SW plus. La selección requerida.

Recoge las células transformadas de la incubadora. La parte más difícil de este procedimiento es la inclusión de las células transformadas en geles agros de bajo porcentaje sin romper la integridad de las células al exponerlas a demasiado calor. Por lo tanto, es importante realizar los siguientes pasos del procedimiento de manera rápida y eficiente: Trabajar en una campana de flujo estéril.

Agregue un mililitro de aase de bajo punto de fusión casi hirviendo a los nueve mililitros de un SW.In uno de los tubos, cierre el tubo e invierta para mezclar. A continuación, añade 0,5 mililitros de células recién transformadas. Cierre e invierta rápidamente el tubo para mezclar y luego vierta su contenido en la placa de Petri.

Repita este proceso con los siete tubos restantes y luego proceda al siguiente matraz de transformación. Deje los platos abiertos en la campana de flujo durante una hora para que el aray se asiente. Luego cubra los platos y transfiéralos con cuidado a grandes placas de Petri cuadradas que contienen cuatro platos redondos cada una.

Dado que los platos no estaban completamente listos, el gel es muy frágil. Tenga cuidado de no romper el gel al manipular los platos. Selle los platos cuadrados con paraform y colóquelos en la incubadora.

Una vez que aparezcan las colonias, use un perpe de 200 microlitros con puntas de corte. Para recoger colonias en una campana estéril, simplemente seleccione colonias libres y succione una colonia verde. Tenga cuidado de no incluir celdas de colonias vecinas.

Transfiera las celdas a dos mililitros de medio líquido que contenga la selección. En un plato de 24 pocillos, mezcle acariciando hacia arriba y hacia abajo. Después de seleccionar 24 o 48 colonias por transformación, selle las placas con film para y transfiéralas a la incubadora.

Después de una semana trasvasar 100 microlitros de cada pocillo a dos mililitros de un SW fresco con selección. En una placa de 24 pocillos, crezca durante siete días adicionales. Las líneas celulares supervivientes se pueden utilizar para estudios posteriores al transformar cinco microgramos de ADN linealizado.

Con este protocolo, deberían aparecer de 20 a 60 colonias por placa de transformación después de dos a tres semanas. Aproximadamente el 80% de las colonias seleccionadas fueron seleccionadas positivamente por resistencia a antibióticos en medio líquido, y se utilizaron en estudios posteriores siguiendo este procedimiento.

Posteriormente, se pueden realizar otros métodos, como la PCR o la transferencia de Southern blot, para verificar el número de inserción y la ubicación del gen de la fosa después de su desarrollo. Esta técnica permitió a los investigadores en los campos del reloj circadiano y el ciclo celular comprender los componentes complejos y los comportamientos de sus respectivos sistemas en este nuevo organismo modelo, Austria Caucus. Tori, Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo generar líneas de caucus de Austria transgénicas.