Name: Transformación de Genómica de la Picoeukaryote Ostreococcus tauri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende a generar líneas transgénicas estables de Ostreococcus tauri mediante electroporación. Este método permite estudiar redes regulatorias genéticas en un modelo de alga marina con complejidad reducida.

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SynthSys un Centro para la Biología de Sistemas Integral financiado por el BBSRC y adjudicación EPSRC D019621. 6 º PM de la UE Red de Excelencia &quot;Genómica Marina&quot; subvención a FYB ha financiado el desarrollo de métodos de transformación genética.

1. Preparación del material de algas <ol><li> Las células se cultivan en Ostreococcus agua de mar artificial (ASW). Sales del mar (típicamente alrededor de 40 gramos por litro) se disuelven en agua desionizada a una salinidad de 30 ppm, según se mide utilizando un medidor de salinidad. Medio de enriquecimiento 11,12, elementos traza de metales y vitaminas se añaden como se describe en las Tablas 1-3. Los medios de comunicación es entonces esterilizada por filtración a través de un filtro de 0,22 um. </li><li> Para el mantenimiento, las células de la cepa Ostreococcus OTTH95 son sub-cultivadas asépticamente a una dilución de 1/100 en fresco ASW cada 7 días y cultivadas bajo luz constante en una planta de crecimiento incubadora equipado con Moonlight Blue filtro. La intensidad de la luz debe estar cerca de 20 mol m -1 -2 s y la temperatura se mantiene a 20 ° C. Las células no requieren agitación constante, pero se agitó una vez cada 2 a 3 días para evitar la agregación. </li><li> Para cada transformación, 50 ml de células que se requieren en una celda density de 20-30 x 10 6 ml -1, lo que debe ser alcanzado de 5-7 días después de sub-cultivo. Densidad celular aproximado y axeny se puede determinar utilizando citometría de flujo o un hemocitómetro en un mínimo de magnificación x40. </li></ol> 2. La electroporación <ol><li> Preparar ADN para la transformación. Para cada transformación, 5 g de ADN puro, el plásmido linealizado se requiere en una concentración de 1 mg / l en agua desionizada estéril. Para obtener este ADN, los autores recomiendan utilizar un kit de Qiagen Midi de preparación, aunque otros métodos podrían funcionar igualmente bien. Digerir el producto con una enzima que corta en el esqueleto del vector utilizado, pero no en el transgén o gen de selección. Además purificar y concentrar el ADN lineal resultante mediante precipitación con etanol, y resuspender el producto en el volumen adecuado de agua de alta calidad desionizada estéril. </li><li> Preparar tubos de microcentrífuga que contienen 5 mg de ADN para cada transformación. Una controversial con ningún ADN es necesaria para cada línea celular de ser transformado. Mantener estos tubos en hielo, junto con una cubeta de electroporación de 2 mm para cada transformación. </li><li> Preparar 2,2 ml de tampón de resuspensión por transformación. Disolver sorbitol a una solución 1 M en ddH 2 O, añadir 0,1% de ácido Pluronic F68 y filtro esterilizar. </li><li> Añadir ácido Pluronic F68, a una concentración final de 0,1% a las células, y el pellet ellos durante 10 minutos a 8000X g en 10 ° C en un tubo de 50 ml con fondo cónico. Inmediatamente resuspender las células en 1 ml de tampón de resuspensión pipeteando arriba y hacia abajo, y transferir a un tubo de microcentrífuga. Haga girar durante 10 minutos a 8000 xg a 10 ° C, y trabajar con rapidez, repita este paso de lavado, una vez más. </li><li> Con una punta de corte, resuspender cada final precipitado en 40 l de tampón de resuspensión. Añadir 40 l de las células resuspendidas a cada tubo de ADN linealizado en hielo, mezclar suavemente y transferir a la cubeta de electroporación. </li><li> Colocar la cubeta en el electroporación de la máquina. Cambie la configuración de 6 kV cm -1, 600 Ω y 25 mF. Electroporate las células. </li><li> Se incuban las células electoporated en las cubetas a temperatura ambiente durante 10 minutos, y utilizar ese tiempo para preparar los frascos de cultivo de tejidos. Etiqueta y añadir 30 ml de ASW fresca a cada uno. Tomar 1 ml de cada frasco y agregar suavemente a la cubeta correspondiente. Incubar durante 2 minutos y retire con cuidado la ASW, que ahora contiene el glóbulo de las células y suave y lentamente la pipeta directamente en la guerra antisubmarina en el frasco de cultivo. </li><li> Las células suelen permanecer en un glóbulo. Tenga cuidado de no mover o perturbar a las células agregadas en este momento. Permitir a las células para recuperar en la incubadora durante 1-2 horas, a continuación, volver a suspender agitando los frascos. En este momento, las células deben resuspender libremente y sin grumos debe ser visible. Deja las culturas para recuperar toda la noche en la incubadora. </li></ol> 3. La inclusión de las células en las placas en un medio semisólido <ol><li&gt; Al día siguiente, autoclave una solución de bajo punto de fusión 2,1% de agarosa en ddH 2 O en una botella que contiene una varilla de agitación. Mantener fundido a 65-90 ° C en un vaso de precipitados grande que contiene agua en un agitador magnético calefacción. Para cada transformación preparar 8 placas de Petri (55 mm de diámetro) y 8 x 15 ml conteniendo cada uno los tubos 9 ml de ASW más la selección requerida. Si se utiliza nourseothricin o G418, utiliza 2 mg / ml. </li><li> Recoger las células transformadas de la incubadora. Trabajar en un Flowhood estéril, añadir 1 ml de la ebullición de agarosa LMP a la 9 ml en uno de los tubos. Cerrar el tubo y mezclar por inversión. A continuación, agregue 0,5 ml de células recién transformadas, mezclar rápidamente y verter en el plato. Repita este proceso con los restantes 7 tubos y luego proceder a la transformación del frasco siguiente. </li><li> Deja las placas de abrir en la campana de flujo durante una hora, por la agarosa a establecer. A continuación, cierre las placas y los transfieren a los grandes cuadrados placas de Petri, que tendrá 4 platos cada una. Selle el ingenio placas cuadradash parafilm. Nótese que las placas no se establece completamente, y como resultado, el gel es muy frágil. Se debe tener cuidado de no romper el gel al manipular las placas. Coloque todos los platos cuadrados en la incubadora. </li></ol> 4. La selección de colonias transformadas <ol><li> Las colonias deben aparecer después de 10 a 21 días en las placas de transformación, pero no en las placas falsas transformadas. Para escoger las colonias con una pipeta 200 l con corte de puntas. Sólo tiene que seleccionar las colonias libres y aspirar a la colonia de color verde. Tenga cuidado de no incluir a todas las células de las colonias vecinas. </li><li> Transferir las células a 2 ml de medio líquido que contiene la selección, en una placa de 24 pocillos. Cuando se utiliza nourseothricin, utilice 1,75 mg / ml. Mezclar pipeteando arriba y hacia abajo. Seleccione 24-50 colonias por la transformación. Sellar las placas con parafilm y la transferencia a la incubadora. </li><li> Después de una semana, deben verterse 100 l de cada pocillo a 2 ml fresca ASW con la selección en una placa de 24 pozos y crecer de una additional 7 días. Supervivientes líneas celulares pueden ser utilizados para estudios posteriores. Integración estable en el genoma y número de inserción debe ser analizado mediante PCR y Southern Blot. El ADN genómico puede obtenerse para estos fines utilizando cualquier método estándar abajo en escala de planta para la extracción de ADN. </li></ol> 5. Los resultados representativos Las células dividir 1/100 alcanza una densidad de 25 millones de células por mililitro después de crecer durante 7 días. La electroporación de las células con los ajustes apropiados como resultado una constante de tiempo de entre 10 y 14 milisegundos. Cuando las células se transfirieron a un medio en matraces de cultivo, un glóbulo de células deben formar. Al agitarse ligeramente después de una hora, las células con facilidad, deben suspender de nuevo. La inclusión de 1 ml de células transformadas en agar LMP 0,2% debería resultar en un consistente, pero sólo gel semi-sólido. Las colonias deben aparecer después de 10 a 21 días. Cuando la transformación de 5 ug de ADN linealizado utilizando el protocolo anterior, 50-100 colonias por la transformaciónplaca se espera normalmente, versus ninguno en las placas de control negativo. ~ 80% de las colonias recogidas fueron seleccionados positivamente por la resistencia a los antibióticos en medio líquido y se utilizaron en los estudios posteriores. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentración final </td><td> Solución madre </td><td> Volumen para 1 litro </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / l H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3,63 x 10 -5 M </td><td> 2,68 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> β-glicerofosfato </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2,16 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Tris-base (pH 7,2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121,1 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> K traza solución de metal </td><td></td><td> Tabla 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> f / 2 solución de vitaminas </td><td></td><td> Tabla 3 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los componentes del medio de crecimiento de O. tauri 11, 12. conseguir un volumen total de 1 litro de agua de mar artificial a una salinidad de 30 ppm, y añadir los componentes anteriores de soluciones madre como se indica. Filtrar a esterilizar el medio y su uso dentro de una semana. Las existencias de todos los compuestos excepto la solución de vitaminas pueden ser agrupados para añadir 6 ml de esta solución por cada litro de medio. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentración final </td><td> Solución madre </td><td> Cantidad para 1 litro </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22,0 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10,0 g / L de dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / L dH <sub&gt; 2 S </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Trazar solución de metal 11,12. Hacer hasta un total de 1 litro, en dH 2 O, y el calor para disolver. Alícuota de la solución y congelación para su almacenamiento. Las concentraciones finales indicadas se refieren al medio final no, la solución de metales traza. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentración final </td><td> Solución madre </td><td> Cantidad para 1 litro </td></tr><tr><td> La vitamina B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / l DH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Biotina </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0,1 g / L de dH 2 O </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> • Tiamina HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tabla 3. f / 2la vitamina solución de 11. Completar hasta un total de 1 litro en dH 2 O, el filtro a esterilizar, alicuotar y congelar. Las concentraciones finales indicadas se refieren al medio final no, la solución de vitaminas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Figura 1. Representación gráfica del procedimiento de transformación. Representación esquemática del procedimiento para transformar genéticamente Ostreococcus tauri por electroporación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Figura 2. Las células de crecimiento Cultura. Son sub-cultivados asépticamente en una dilución de 1/100 en agua dulce ASW cada 7 días y crecido bajo la luz constante en un crecimiento de la planta incubadora equipado con filtro de luz de la luna azul. La intensidad de la luz debe estar cerca de 20 mol m -2 s -1 y la temperatura se mantiene a 20 ° C las células no requieren agitación constante, pero son shaken una vez cada 2 a 3 días para evitar la agregación. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Figura 3. La formación de colonias en el 0,2% de agarosa LMP. Transferencia de 4 platos a un plato de Petri gran plaza, y el sello con parafilm (arriba izquierda). Cuando las colonias se han formado, sólo tiene que seleccionar libres (lo ideal es de forma cónica) colonias (arriba derecha) y aspirar a salir de la placa con una pipeta P200. No debe haber colonias en el control negativo (inferior derecha).

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Axeny Celular Estado y la cultura es de vital importancia para el procedimiento de transformación. Aunque las células se mantienen normalmente en ciclos de 12 horas de luz, 12 horas oscuro, la eficiencia de transformación en las células cultivadas bajo estas condiciones se encontraron a ser insuficiente. Durante los repetidos granulación / resuspensión pasos, las células deben siempre resuspender fácilmente. Si el agregado células, o de una sustancia con apariencia de moco está presente, es mejor iniciar el procedimiento desde el principio otra vez. Típicamente, ~ 50 colonias se puede esperar en cada placa de transformación, frente a ninguno en la placa de control negativo. En el caso de la eficiencia de transformación bajo, condiciones de cultivo deben ser variados para asegurar las células están en el estado óptimo. Variables que afectan la eficiencia de transformación se encuentran la temperatura ambiente en el laboratorio (en caso de estar cerca de 20 ° C) y velocidad de manipulación (Procedimiento de la sedimentación de células [2,3] para la recuperación [2,7] se deberían tener aproximadamente 1 hora). También es importante que todas las soluciones aRe frescas antes de cada transformación. Para su inclusión en las placas, la concentración de agarosa LMP es crucial. Células Ostreococcus no crecerá en altas concentraciones de agarosa, y se difundirá en bajas concentraciones. Tres vectores de transformación para Ostreococcus han sido publicados anteriormente 6, y más vectores se espera que se genera y se publicará en breve. El vector existente Pot-Luc 6 permite el uso de un promotor de elección en combinación con una etiqueta C-terminal de la luciferasa de luciérnaga permitiendo la selección de línea más rápida transgénico más manejables patrones de expresión, mientras que el vector Potox 6 lleva el promotor inducible fuerte 13 tomada desde el Ostreococcus Fosfato de alta afinidad Transportador (HAPT) de genes para la sobreexpresión del gen de interés. El vector Potox-Luc deriva de Potox, llevando un marcador luciferasa adicional que puede ser utilizado para la selección indirecta de las líneas de sobreexpresión <sa&gt; 14. El éxito de los marcadores de selección en estos vectores son nourseothricin y G148. Sin embargo, las células Ostreococcus son altamente resistentes a muchos antibióticos, y las concentraciones de los compuestos necesarios para la selección de las células transgénicas Ostreococcus es mayor que para los sistemas de modelo convencional (2 mg / ml). Aunque el proceso parece ineficiente, el gran número de células y el ADN plásmido necesaria para este procedimiento no plantea ningún obstáculo significativo. Una limitación más importante es que cada línea generada que es resistente al marcador seleccionable necesita ser analizada individualmente para comprobar que toda la estructura se integra en el ADN. Hemos observado ejemplos en los que la expresión con éxito de la marcador seleccionable no corresponden a la inserción del gen de interés real; integraciones parciales, es decir puede ocurrir. Evidentemente, la inserción aleatoria en el genoma también significa que no hay control de la zona de inserción utilizando este método, y b métodoson base en la recombinación homóloga se están desarrollando actualmente. Sin embargo, el método descrito aquí es, a nuestro leal saber y entender, actualmente el único método caracterizado para generar células modificadas genéticamente Ostreococcus. Como Ostreococcus tauri sólo recientemente ha sido utilizado como un organismo modelo experimental, la mayoría de los métodos de trabajo con estas células es probable que evolucionar y ser refinado por la comunidad científica cada vez más involucrados. Este protocolo está pensado para ayudar a la gente a iniciar el trabajo con Ostreococcus, pero de ninguna manera pretende describir todo lo que hay que saber acerca de la transformación genómica de esta microalga. Los autores la confianza que los lectores serán capaces de adaptar este protocolo a sus propias necesidades como las pequeñas diferencias en las incubadoras (los niveles de luz o de calidad) y otros parámetros que existen y que probablemente tienen que ser optimizadas en cada laboratorio en particular para obtener las culturas saludables necesarios para este protocolo. Después de dominar las técnicas descritas aquí,vectores pueden ser construidos para generar fluorescente luminiscente, u otros etiquetados líneas de fusión bajo el control de una amplia gama de promotores. Esta plataforma apasionante novela experimental será útil para estudiar cómo complicados problemas bioquímicos se resuelven en un eucariota de la reducción de la complejidad, en que los enfoques farmacológicos son muy facilitada 3.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Los componentes del medio </td></tr><tr><td> Químico </td><td colspan="2" > Número de catálogo </td><td> Proveedor </td></tr><tr><td> Instant Ocean Marine Sal </td><td colspan="3"> de <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> o <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glicerol 2-fosfato disódico hidrato de sal </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultrapura tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> La vitamina B 12 (cianocobalamina) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotina </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> • Tiamina HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomicina </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Consumibles para el cultivo </td></tr><tr><td colspan="2"> Artículo </td><td> Número de catálogo </td><td> Proveedor </td></tr><tr><td colspan="2"> Cultivo de Tejidos Flask T25 cultivos en suspensión ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Cultivo de Tejidos matraz T75 cultivos en suspensión ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Cultivo de Tejidos Flask T175 cultivos en suspensión ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP filtros para botellas, 1l, completos </td><td> 99950T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP filtros para botellas, 500 ml, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP filtros para botellas, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP filtros para botellas, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> La salinidad del medidor para el Acuario Marino </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Productos químicos para la transformación </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Catálogonúmero </td><td> Proveedor </td></tr><tr><td> D-Sorbitol </td><td> S6021-1kg </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 solución </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Bajo punto de fusión de agarosa </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Consumibles para la transformación </td></tr><tr><td> Artículo </td><td> Número de catálogo </td><td> Proveedor </td></tr><tr><td> Cultivo de Tejidos Flask T25 cultivos en suspensión ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Cultivo de Tejidos matraz T75 cultivos en suspensión ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Frasco de cultivo de tejidos T175 Suspensión Cultures ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner tubos de centrifugación de 50 ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser Cubetas, 0,2 cm, la brecha 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petri plato redondo PS 3 ORIFICIOS H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Placa de Petri cuadrada con cuatro orificios de poliestireno estéril por 120 mm de la irradiación clara </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Moonlight Blue filtro de luz </td><td> 183 </td><td> Lee Lighting </td></tr></tbody></table>

transformación de genómica de la picoeukaryote<em&gt; ostreococcus tauri</em

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Los problemas más comunes que impiden un rápido progreso en Ciencias de la planta incluyen tejido celular y la complejidad del organismo, y en particular el alto nivel de redundancia genómica que afecta a la genética simples en las plantas superiores. La novela de organismo modelo Ostreococcus Tauri es la más pequeña de vida libre eucariota conocido hasta la fecha, y posee un tamaño de genoma reducido en gran medida la complejidad celular y 1,2, que se manifiesta por la presencia de sólo uno de la mayoría de los orgánulos (mitocondrias, los cloroplastos, pila de Golgi) por celda, y un genoma que contiene sólo ~ 8000 genes. Además, la combinación de unicellularity y fácil cultivo proporciona una plataforma susceptible de enfoques de biología químicos. Recientemente, Ostreococcus ha sido empleado con éxito para estudiar los mecanismos básicos que subyacen a la hora normal circadiano 3-6. Los resultados de este organismo modelo han tenido un impacto no sólo ciencia de las plantas, sino también la biología de los mamíferos 7. Este ejemplo pone de relieve cómo la experimentación rápida en uneucariota sencillo del linaje verde puede acelerar la investigación en organismos más complejos mediante la generación de hipótesis comprobables mediante métodos técnicamente viables sólo en este contexto de menor complejidad. El conocimiento del genoma y la posibilidad de modificar los genes son herramientas esenciales en cualquier especie de modelo. 1 Genómica, transcriptómica 8, 9 y Proteómica información para esta especie está disponible gratuitamente, mientras que los métodos reportados previamente 6,10 para transformar genéticamente Ostreococcus se sabe que pocos laboratorios en el mundo. En este artículo, los métodos experimentales para transformar genéticamente este organismo modelo nuevo con una sobreexpresión construir mediante electroporación se describen en detalle, así como el método de inclusión de las células transformadas en porcentaje de agarosa de bajo para permitir la selección de líneas transformadas procedentes de una sola transformada celular. A raíz de la aplicación exitosa de OstreocoCCU a la investigación circadiano, el interés creciente en Ostreococcus se puede esperar de diversas áreas de investigación dentro y fuera de las ciencias de las plantas, incluidas las áreas biotecnológicas. Los investigadores de una amplia gama de ciencias biológicas y médicas que trabajan en conservadas vías bioquímicas puede considerar la investigación buscando en Ostreococcus, libre de la complejidad genómica y organismal de las especies modelo más grande.

En este artículo se describe la transformación genética del alga marina unicelular<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; Por electroporación. Este organismo eucariota es una plataforma modelo eficaz para las plantas superiores, que parecen haber reducido en gran medida la complejidad genómica y celular y ser fácilmente susceptibles de cultivo celular y biología química.

Transformación de Genómica de la Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Los problemas comunes que obstaculizan el progreso rápido en las ciencias vegetales incluyen la complejidad celular, tisular y de todo el organismo y, notablemente, el alto nivel de genómica...

El objetivo general de este procedimiento es generar y seleccionar líneas transgénicas estables del nuevo organismo modelo, Austria Occus Tori, una especie marina de alga eucariota pico. Esto se logra primero generando pellets celulares a partir de 50 mililitros de cultivo denso de ALG por transformación. El segundo paso consiste en mezclar las células con ADN linealizado y luego realizar la electroforesis.Después de diluir las células transformadas en medio fresco e incubarlas durante la noche, agregue agarosa de punto de fusión bajo al 0,2 % y un agente selectivo, y vierta la mezcla en placas de Petri pequeñas. El paso final consiste en seleccionar las colonias resultantes que habrán crecido tras dos o tres semanas de incubación bajo luz azul constante. Finalmente, la selección en medio líquido y análisis moleculares posteriores, como PCR y transferencia Southern, se utilizan para demostrar la integración exitosa del constructo en el genoma de las líneas transgénicas generadas.La principal ventaja de utilizar este organismo frente a organismos modelo existentes como Arabidopsis es reducir considerablemente la complejidad genómica, lo que permite el estudio de redes reguladoras en un contexto con prácticamente ninguna redundancia genética. Aunque en mi laboratorio hemos utilizado osteo occus para estudiar el reloj circadiano de las plantas, también puede emplearse para investigar muchas otras redes celulares complejas. Por lo tanto, las implicaciones de esta técnica van mucho más allá del ámbito de la biología vegetal.La demostración visual de este método es fundamental porque, aunque los pasos individuales parecen bastante simples, el manejo adecuado de las células y un flujo de trabajo eficiente son esenciales para obtener un buen resultado. Partes de este procedimiento serán demostradas por Culin Kish, una asistente de investigación de un laboratorio. Las células Austria Occus se aclimatan en agua de mar artificial o en a SW para preparar una SW disolviendo 40 gramos por litro.Disolver sales marinas en agua desionizada hasta alcanzar una salinidad de 30 partes por mil o PPT, según medición. Utilizando un medidor de salinidad, agregar enriquecimiento, elementos traza de medio y vitaminas, y luego filtrar esterilizando a través de un filtro de 0,22 micrones células brutas de la cepa Austria cocus O TT H 95 en un SW bajo luz constante. En un incubador de crecimiento vegetal equipado con un filtro azul de luz lunar, la intensidad lumínica debe ser cercana a 20 micromoles por metro cuadrado por segundo, y la temperatura mantenerse a 20 grados Celsius. Las células no requieren agitación constante, pero deben agitarse una vez cada dos o tres días para prevenir agregación.Para el mantenimiento, pase los cultivos a fresco de forma aséptica con una dilución de uno a 100 en SW fresco cada siete días. Cada transformación requiere 50 mililitros de células con una densidad celular de 20 a 30 × 10⁶ células por mililitro. Esta densidad debe alcanzarse entre cinco y siete días después del subcultivo.La densidad celular aproximada y el axe pueden estimarse en un hemocitómetro con un aumento mínimo de 40 veces. La magnificación o preferiblemente se determina mediante citometría de flujo. A continuación se muestra un ejemplo de cultivos sanos frente a insanos.Cada gráfica paramétrica muestra la dispersión lateral o SSC en el eje y frente a la fluorescencia roja por célula o FL tres en el eje x. FL tres representa la fluorescencia roja de clorofila, y SSC indica el tamaño celular relativo. Las células sanas quedan dentro de la ventana Austria Occus, mientras que las células en muerte o las bacterias contaminantes quedan fuera de esta ventana.En condiciones ideales, más del 99 % de las células deben estar dentro de la ventana Austria Occus. Para una transformación genética eficiente, cada transformación requiere cinco microgramos de plásmido linealizado puro, ADN a una concentración de un microgramo por microlitro. En agua desionizada estéril, el plásmido ha sido linealizado mediante una enzima que corta en el armazón del vector utilizado, pero no en el transgén ni en el gen de selección.Mantenga el tubo de microcentrífuga que contiene ADN en hielo junto con una cubeta de electroforesis de dos milímetros para cada transformación. Es necesario un control sin ADN para cada línea celular que se transforme. Para cada transformación, transfiera 50 mililitros de células a un tubo con fondo cónico, agregue ácido F 68 al 0,1% y centrifugue durante 10 minutos a 8.000 × g a 10 grados Celsius.Para pelotar las células, deseche inmediatamente el sobrenadante y agregue un mililitro de tampón de suspensión Resus a las células. Suspender las células mediante pipeteo arriba y abajo, transfiéralas a un tubo microfugado y centrifugue durante 10 minutos a 8.000 ×g a 10 grados Celsius. Trabajando rápidamente, lave las células una vez más tras la segunda centrifugación.Corte la punta de una pipeta P200 para resuspender cada pellet en 40 microlitros de suspensión de resuspensión. Añada 40 microlitros del tampón de las células resuspendidas a cada tubo de ADN linealizado en hielo. Mezcle suavemente y transfiera a la vial de electrotransformación.Coloque el vete en la máquina de electropermeabilización. Ajuste la configuración a seis kilovoltios por sensor recíproco, 600 ohmios y 25 microdías. Electrooperar las células después de la electropermeabilización.Incube las células en las cubetas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Durante este tiempo, etiquete los frascos de cultivo celular y agregue 30 mililitros de a SW fresco a cada frasco. Tome un mililitro de a SW de cada frasco y añádalo suavemente al vete correspondiente e incube durante dos minutos.A continuación, retire suavemente un SW que ahora contiene el grumo de células y vierta lentamente y con cuidado directamente en un SW. En el frasco de cultivo, las células normalmente permanecerán en un grumo grande. Tenga cuidado de no agitar ni perturbar las células agregadas en este momento. Deje que las células se recuperen en el incubador durante una a dos horas.Finalmente, resuspenda las células agitando manualmente el matraz. En este punto, las células deben resuspenderse libremente y no deben observarse grumos. Deje que los cultivos se recuperen durante la noche en el incubador; al día siguiente de la electrotransferencia, autoclave una solución de 2,1 % de agarosa de punto de fusión baja en agua doblemente destilada en un frasco que contenga una varilla agitadora.Mantenga fundido a 65-90 grados Celsius en un vaso de precipitados más grande que contiene agua sobre un agitador magnético calefactor. Para cada transformación, prepare ocho placas de Petri de 50 milímetros y ocho tubos de 50 mililitros que contengan nueve mililitros cada uno de un medio SW más. La selección requerida.Recolecte las células transformadas del incubador. La parte más difícil de este procedimiento es la inclusión de las células transformadas en geles de agarosa de bajo porcentaje sin romper la integridad de las células al exponerlas a demasiado calor. Por lo tanto, es importante realizar los próximos pasos del procedimiento de forma rápida y eficiente trabajando en una cabina de flujo estéril.Agregue un mililitro de agar de punto de fusión baja cerca del punto de ebullición a nueve mililitros de un SW. En uno de los tubos, cierre el tubo e inviértalo para mezclar. A continuación, agregue 0,5 mililitros de células recién transformadas. Cierre rápidamente e invierta el tubo para mezclar, y luego vierta su contenido en la placa de Petri.Repita este proceso con los siete tubos restantes y luego continúe con el siguiente matraz de transformación. Deje las placas abiertas en la cabina de flujo laminar durante una hora para que el medio solidifique. Luego, tape las placas y transpórtelas cuidadosamente a placas Petri cuadradas grandes, cada una de las cuales contiene cuatro placas redondas.Dado que los platillos no se solidificaron por completo, el gel es muy frágil. Tenga cuidado de no romper el gel al manipular los platillos. Selle los platillos cuadrados con paraformo y colóquelos en la incubadora.Una vez que aparezcan las colonias, utilice una pipeta de 200 microlitros con puntas cortadas. Para seleccionar colonias en una cabina estéril, simplemente elija colonias aisladas y aspire una colonia verde. Tenga cuidado de no incluir células de colonias vecinas.Transfiera las células a dos mililitros de medio líquido que contenga el agente de selección. En una placa de 24 pocillos, mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Después de seleccionar 24 o 48 colonias por transformación, selle las placas con película de parafina y transfiera al incubador.Después de una semana, transfiera 100 microlitros de cada pocillo a dos mililitros de SW fresco con selección. En una placa de 24 pocillos, cultive durante siete días adicionales. Las líneas celulares sobrevivientes pueden entonces utilizarse para estudios posteriores al transformar cinco microgramos de ADN linealizado.Usando este protocolo, deben aparecer entre 20 y 60 colonias por placa de transformación después de dos o tres semanas. Aproximadamente el 80 % de las colonias seleccionadas fueron positivas por resistencia a antibióticos en medio líquido y se utilizaron en estudios posteriores siguiendo este procedimiento.Se pueden realizar posteriormente otros métodos como PCR o hibridación Southern para verificar el número y la ubicación de la inserción del gen transgénico tras su desarrollo. Esta técnica permitió a los investigadores en los campos del reloj circadiano y del ciclo celular comprender los componentes y comportamientos complejos de sus respectivos sistemas en este nuevo organismo modelo, Austria caucus. Tori, después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo generar líneas transgénicas de Austria caucus.

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Research

Investigación

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Biology

Biología

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Transformación de Genómica de la Picoeukaryote

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