Screening prodotti alimentari per la Classe 1 integroni e Gene cassette

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un approccio semplificato per l'individuazione degli sfondi di classe uno e delle cassette genetiche associate a partire dai prodotti alimentari. Ciò si ottiene creando prima una coltura batterica arricchita dall'alimento scelto. Il secondo passo consiste nello screening della coltura per la presenza di inter di classe uno utilizzando la PCR e isolando le singole colonie dalla coltura mista interpositiva.

Dopo lo screening delle singole colonie per la presenza di integroni, preparare il DNA genomico dalle singole colonie per la PCR diagnostica per differenziare le specie batteriche e rilevare la presenza di cassette geniche. Il passaggio finale consiste nel purificare i prodotti PCR e sottoporli all'analisi della sequenza del DNA. In definitiva, l'analisi della sequenza del DNA viene utilizzata per caratterizzare le cassette geniche all'interno di un'inter di classe uno e identificare le specie in cui risiedono.

La resistenza agli antibiotici è uno dei principali problemi che le cure mediche devono affrontare nel 21° secolo. Uno dei modi in cui possiamo gestire la resistenza agli antibiotici è rilevare e tracciare i geni di resistenza agli antibiotici nell'ambiente, dall'uomo all'ambiente e viceversa. Questo protocollo ti mostrerà come rilevare la resistenza agli antibiotici.

Geni in alimenti che potremmo mangiare crudi o con una lavorazione minima. La procedura sarà dimostrata da Leet Waldron, un postdoc che lavora nel mio laboratorio. Gli alimenti che vengono consumati crudi o leggermente cotti, come frutta, verdura e crostacei, sono i più preoccupanti per la salute umana.

Qui verrà dimostrata solo la preparazione di colture arricchite dai frutti di mare. Si prega di fare riferimento al testo del protocollo per la preparazione di colture da frutta e verdura. Per preparare una coltura arricchita dai frutti di mare, usa prima pinze e pinzette sterili per sezionare il tratto digestivo dai gamberi.

Mettere il materiale sezionato in una provetta sterile da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di tampone fosfato di sodio. Macerare il campione utilizzando un pestello per creare un omogeneizzato e un vortice. Erogare brevemente cinque millilitri di brodo LB in due provette sterili da cinque millilitri e inoculare ciascuna con l'omogeneizzato di pesce.

Agitare entrambe le provette per una notte a 200 OPM, incubando una provetta a 25 gradi Celsius e l'altra a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Conservare le colture a quattro gradi Celsius fino a quando non è necessario recuperare singole colonie da colture miste positive per PCR A. Per prima cosa, diluire in serie la coltura dieci volte in tampone fosfato di sodio aggiungendo un millilitro di coltura mista a nove millilitri di tampone fosfato di sodio miscelato a vortice.

Aggiungere un millilitro della diluizione ad altri nove millilitri di tampone fosfato di sodio e ripetere fino a raggiungere una diluizione seriale di 10 a meno otto sulla piastra. La coltura diluita ha distribuito 100 microlitri di 10 da meno quattro a 10 a meno otto su agar LB. In duplicato, incubare le piastre per una notte alla stessa temperatura utilizzata per la coltura mista iniziale il giorno successivo.

Le singole colonie possono essere selezionate dalle piastre di diluizione seriali. Per la preparazione del DNA, assicurarsi che tutte le piastre e le provette dei campioni siano chiaramente etichettate prima di iniziare. Toccare uno stuzzicadenti sterile su una singola colonia e poi trasferirlo in una provetta per PCR contenente 100 microlitri di acqua sterile.

Gira lo stuzzicadenti tra le dita per rimuovere alcune delle cellule nell'acqua usando lo stesso stuzzicadenti, inocula una piastra LB con una striscia di ogni colonia raccolta. Un gran numero di colonie può essere conservato su piastre etichettate. Se ogni striscia è lunga circa un centimetro, chiudere immediatamente il coperchio per ridurre la contaminazione tra i campioni.

Seleziona il maggior numero possibile di tipi di colonie utilizzando criteri quali le dimensioni, la forma e il colore della colonia. Incubare le piastre LB per una notte alla stessa temperatura utilizzata per la coltura arricchita iniziale. Le colture possono quindi essere conservate a quattro gradi Celsius fino a quando non sono necessarie per preparare il DNA dalle sospensioni batteriche.

Riscaldare i campioni a 99 gradi Celsius per 10 minuti utilizzando una microcentrifuga termociclatore a 14.000 volte, G per cinque minuti a temperatura ambiente per far tornare i detriti delle celle a pellet in ghiaccio. Successivamente eseguire lo screening del DNA mediante PCR con primer HS 4 63 A e HS 4 64. Seguendo le procedure descritte nel testo del protocollo, è importante evitare qualsiasi potenziale fonte di contaminazione del DNA durante l'esecuzione della PCR per valutare i risultati dell'elettro arbitro di amplificazione.

Sette microlitri di ciascun prodotto PCR su un gel al 2%aros versati e versati nel tampone TBE dopo aver colorato il gel con la colorazione del DNA. Visualizzare il DNA utilizzando un transluminatore UV Per queste analisi vengono utilizzati isolati che trasportano un'integrina di classe uno generando una forte banda singola a 471 coppie di basi. Per queste analisi vengono utilizzati DNA genomico preparato da isolati che restituiscono una PCR positiva. Scongelare il DNA genomico sul ghiaccio e girare brevemente a vortice e pulsare a 14.000 volte G per 20 secondi.

Le sequenze di primer e le condizioni di PCR utilizzate per la PCR diagnostica sono mostrate nella tabella uno del manoscritto. Innanzitutto, ripetere la PCR per il gene dell'integrasi di classe oneone per confermare che l'isolato è positivo per la coppia di basi 471 amplicone. Successivamente, identificare le colture positive a livello di specie amplificando il gene dell'RNA ribosomiale a piccola subunità 16 S-R-D-N-A.

Tutti i bersagli batterici dovrebbero generare un amplicone 16 S di circa 1.450 paia di basi, poiché molte di queste colture positive saranno le stesse. Le specie batteriche distinguono le diverse specie per restrizione della digestione del prodotto 16 SPCR. L'enzima di restrizione HIF one è raccomandato poiché genera una buona diversità a partire da bersagli 16 s ed è un enzima affidabile ed economico.

Preparare una miscela master di restrizione da 30 microlitri in una provetta sterile e aggiungere 20 microlitri di prodotto 16 SPCR non purificato. Incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per una notte del giorno successivo, controllare il digestato su un gel AROS al 2% I 16 prodotti SPCR selezionati vengono quindi purificati utilizzando un kit commerciale e inviati a una struttura di sequenziamento per il sequenziamento del DNA. Utilizzare la sequenza di DNA risultante per interrogare il database N-C-B-I-D-N-A con la funzione Blast N superiore al 97%, l'identità nucleotidica viene solitamente considerata come identità di specie.

Gli isolati antibatterici a colture miste vengono sottoposti a screening per la presenza del gene dell'integrasi di classe uno mediante PCR. Utilizzando i primer HS 4 63 A e HS 4 64 le colonie positive generano una forte banda singola a 471 coppie di basi. Genomica, il DNA da isolati puri viene utilizzato per la caratterizzazione di array inter cassette, l'amplificazione di array di cassette da integroni TN 4 0 2 utilizzando i primer HS 4 58 e HS 4 59 genera prodotti di dimensioni variabili a seconda dell'identità e delle dimensioni delle cassette componenti nell'array.

L'identificazione di queste cassette richiede il sequenziamento del DNA Gli integroni ambientali di classe uno sono spesso incorporati nei cromosomi batterici. I loro raggi di considerazione possono essere amplificati dai primer MG 2 84 e MG 2 85 che colpiscono rispettivamente i siti di ricombinazione prossimale e la maggior parte distale. Questa PCR genera anche dimensioni variabili del prodotto a seconda dell'identità e delle dimensioni delle cassette dei componenti nell'array.

Tuttavia, è improbabile che le cassette negli array ambientali codifichino la resistenza agli antibiotici. Le specie batteriche vengono identificate mediante amplificazione di 16 S-R-D-N-A e screening dei prodotti della PCR mediante digestione. Con l'HIF una singola specie genererà modelli distintivi in modo tale che gli isolati della stessa specie possano essere facilmente identificati e confermati dal sequenziamento del DNA.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una buona idea di come isolare gli ingrammi di Classe 1 e le loro cassette di resistenza agli antibiotici dagli alimenti di tutti i giorni.