Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Developmental Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Overview

מיפוי גורל הוא טכניקה המשמשת להבנת האופן שבו תאים עובריים מתחלקים, מבדילים ונודדים במהלך ההתפתחות. בניסויים קלאסיים למיפוי גורל, תאים באזורים שונים של העובר מסומנים בצבע כימי ולאחר מכן במעקב כדי לקבוע אילו רקמות או מבנים הם יוצרים. שיפורים טכנולוגיים מאפשרים כעת לסמן ולאתר תאים בודדים לאורך התפתחות עוברית ובגרות.

סרטון זה סוקר את המושגים שמאחורי מיפוי הגורל, ולאחר מכן מפרט פרוטוקול מיפוי גורל בדגי זברה באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים פוטואקטיביים. לבסוף, יישומים ספציפיים ושינויים של טכניקה ייחודית זו נדונים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ביולוגים התפתחותיים משתמשים במיפוי גורל ככלי להתחקות אחר שושלות תאים בזמן שאורגניזם מתבגר. זה נעשה על ידי תיוג תאים בשלב עוברי ולאחר מכן מעקב אחריהם וצאצאיהם לאורך התפתחות האורגניזם. מיפוי גורל משמש גם לחקר הגירת תאים ובידול במהלך הפיתוח, כמו גם התחדשות ותיקון במהלך הבגרות.

וידאו זה יספק סקירה של מיפוי גורל, להסביר פרוטוקול המשמש ליצירת מפת גורל דגי זברה, ולהראות כמה דרכים שבהן טכניקה זו מיושמת כעת במעבדות.

לפני שנקפוץ לפרטים הפרוצדורליים, בואו נדון מהי מפת גורל וכיצד היא בנויה.

בניסויי מיפוי גורל קלאסיים, מדענים הכתימו קבוצות של תאים בעובר מוקדם, כגון אלה בשלב הגזטרולה, עם צבע שיועבר לכל צאצאי התאים האלה. לאחר שאפשרו לעובר להתפתח לפרק זמן מסוים, הם צפו בתאים המוכתמים באורגניזם הבוגר יותר. מיקום התאים המוכתמים באורגניזם הבוגר צוין אז. תוצאות מלוות של מספר ניסויים דומים אפשרו בניית תרשים המכונה מפת גורל.

לכן, מפת גורל היא תוכנית כוללת המתארת את גורלו של כל חלק של עובר מוקדם. מפות אלה מסייעות למדענים לקבוע דברים כמו אילו תאים עובריים מבדילים בין תאים בוגרים פונקציונליים, וכיצד הם נודדים ומתארגנים למבנים בוגרים.

מדענים השתמשו באורגניזמים מודל רבים כדי ליצור מפות גורל, כולל צפרדעים, נמטודות, דגים, אפרוחים ועכברים. כמה אורגניזמים מודל, כגון דג הזברה דניו rerio, יש יתרון נוסף בסוג זה של ניסוי. מכיוון שהם קטנים ונשארים שקופים במשך רוב התהליך ההתפתחותי, מדענים יכולים לעקוב בקלות אחר תאים על ידי צפייה בדגים תחת מיקרוסקופ אור. חשוב לציין, ההתקדמות בטכניקות תיוג התאים מאפשרת כעת למדענים לסמן במדויק תאים בודדים ולעקוב אחריהם עם התפתחות האורגניזם, מה שעוזר ביצירת מפת גורל מפורטת ביותר.

עכשיו שיש לכם מושג מהן מפות גורל, בואו נדון בפרוטוקול למיפוי גורל בדגי זברה שמשתמש בפוטואקטיבציה. גישה חדשה יחסית זו תלויה בחלבונים פוטואקטיביים. אלה חלבונים פלואורסצנטיים מיוחדים, אשר "בכלוב", כלומר הם מוחזקים בקונפורמציה ספציפית כדי למנוע פלואורסצנטיות. יישום של פעימת לייזר מבוקרת גורם לשינוי קונפורמציה, המכונה "פירוק", וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות גלויה.

על מנת לבצע את הניסוי הזה, חלבונים מיוחדים אלה בכלוב מסונתזים תחילה ולאחר מכן מוזרקים לעובר אחד או שניים של דגי זברה. לאחר מכן, העוברים רשאים להבשיל לשלב ההתפתחותי הרצוי לפני פוטואקטיבציה.

לאחר מכן, כדי להכין את הדגים לפוטואקטיבציה, העוברים הם dechorionated כדי להפוך את רקמת היעד נגיש. לאחר מכן, הם מותקנים במדיום ברור אופטית, כגון agarose טמפרטורת התכה נמוכה, אשר שומר אותם בבטחה במצב יציב. הדגימות מיושרות כדי לחשוף את אזור העניין, ומורכבות על מיקרוסקופ מצויד בלייזר. פעימת לייזר מוחלת על האזור הממוקד המכיל תאים מעניינים, גרימת פוטואקטיבציה.

לאחר טיפול הלייזר, עוברים מוסרים בזהירות מן האגורוז ומוחזרים לסביבתם הטבעית עד להגעה לשלב ההתפתחותי הרצוי. על מנת לעקוב אחר התאים photoactivated, עוברים מוטבעים שוב בטמפרטורת התכה נמוכה agarose, ואת התאים photoactivated ניתן לדמיין ועקבות באמצעות פלואורסצנטיות ישירה או חיסונים.

עכשיו שיש לכם הבנה כוללת של פרוטוקול מיפוי גורל, בואו נסתכל על כמה ניסויי מעבדה שמנצלים את ההליך הזה.

בנוסף לחקר התפתחות העובר, ניתן להשתמש במיפוי גורל כדי לבחון תיקון במערכות בוגרות. בניסוי זה, תת-סוג תא מסוים הובל מרשתית דגי זברה מהונדסת. לאחר מכן איתרו המדענים תאי גזע בוגרים בעלי תווית גנטית כדי לקבוע את גורלם בעקבות פציעה. לבסוף, בוצע ניתוח תמונה, אשר הדגים הפעלה של תאי גזע בוגרים ותיקון רקמות לאחר מכן.

מדענים משתמשים גם בפרוטוקולים דומים כדי להבין את גורלם של תאי גזע מושתלים. כאן, תאי גזע עובריים אנושיים מתויגים גנטית, או hESCs, הושתלו במודל עכבר אימונוקום. התאים המושתלים הורשו להבדיל במשך 8-12 שבועות, ולאחר מכן הטרטומה המתקבלת, שהיא גידול המכיל רקמה משכבות נבט מרובות, נקצרה, תוקנה וחיסון כדי לקבוע את גורלם של תאי גזע מושתלים. סוג זה של ניסוי מסייע למדענים לאשר את הפוטנציאל המבדיל של תאי גזע בתרבית.

כאמור, מדענים מבצעים הליכי מיפוי גורל באורגניזמים שונים, כולל יונקים. במחקר מסוים זה, מדענים סימנו תאים באזור מסוים של עובר עכבר מוקדם באמצעות גישות גנטיות בלתי אכילות. זה נעשה על ידי מתן סוכן גרימת עכבר בהריון נושא צאצאים מהונדסים גנטית. התאים המסומנים היו במעקב לאורך שלבים התפתחותיים מאוחרים יותר, אשר סייעו למדענים לקבוע את גורלם הסופי.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על מיפוי גורלות. סרטון זה סיפק תובנה מסוימת על יצירת מפות גורל, סקר פרוטוקול מיפוי גורל ספציפי, ודן בכמה מהשינויים והיישומים של טכניקה שימושית זו. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter