Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a formação e organização do fuso miótico em Cytes após a depleção mediada por irna de proteínas-chave associadas ao MTOC, como a perrina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em um campo de biologia reprodutiva, como os mecanismos que regulam a segregação cromossômica e possíveis interrupções que levam à aneuploidia em todos os locais. A principal vantagem dessa técnica é que ela resulta em transcrição eficiente, knockdown e análise de imunofluorescência específica de citos individuais.

Este procedimento também pode ser adaptado para estudar quase qualquer proteína-alvo 48 horas antes do dia da coleta tratar Os camundongos fêmeas usados para coleta de oócitos com cinco unidades internacionais de PMSG injetadas intraperitoneal após a coleta dos ovários usando práticas padrão. Transfira para um prato de meio MEM pré-aquecido e equilibrado suplementado com BSA e mil reona e prepare-se para isolar os citos sob um microscópio de dissecação. Libere os complexos de cúmulos ou COCs fixando um ovário no fundo da placa de cultura usando uma agulha de calibre 27 e use uma segunda agulha para perfurar os folículos antrais usando aspiração de oócitos ou prática padrão de pipetagem bucal.

Colete os oócitos cercados por duas ou mais camadas de células compactas do cumulus. Transfira esses COCs para um novo prato com M-E-M-B-S-A reone suave e incube-os por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, prossiga com o desnudamento dos citos usando métodos padrão.

Preparar a placa de cultura por injecção com três mililitros de M dois meios com um micrograma por mililitro de milona. Prepare também a louça de lavar e cultivar com milone M-E-M-B-S-A. Em seguida, carregue cinco microlitros da solução de INA milimolar na agulha de injeção e configure-a para a microinjeção.

Agora coloque uma gota de 100 microlitros de M dois meios na tampa de um prato de três centímetros. Carregue um oócito na gota e use-o para ajustar a posição da pipeta de retenção. Fixe o local da OEA conectando-o à pipeta de retenção usando pressão negativa.

Em seguida, ajuste a posição da agulha de injeção para o diâmetro mais largo do oócito. Uma vez posicionado, injetar cerca de 10 picolitros de solução no citoplasma do oócito, evitando o núcleo. Retorne a tampa ao estágio de microscópio estéreo e adicione 100 microlitros de M dois meios frescos.

Coloque cerca de 10 citos na mídia. Em seguida, no estágio de microinjeção, prossiga com a microinjeção. Prenda cada oócito com a pipeta de retenção e insira lentamente a agulha de injeção no citoplasma.

Injete a solução de Sirina e retraia cuidadosamente a pipeta de injeção. Mova os citos injetados com sucesso para uma extremidade da gota e mova os citos injetados sem sucesso para a extremidade oposta da gota. Deve levar apenas alguns minutos para injetar 10 citos, o que é fundamental para manter sua viabilidade.

Mova a tampa para o estágio de microscópio estéreo e transfira todas as células injetadas com sucesso para um prato de M-E-M-B-S-A Mel conhecido a 37 graus Celsius. Transfira os citos para uma incubadora de 37 graus Celsius com uma atmosfera de gás medicinal e incube por 24 horas. Comece liberando os citos do bloco mil-reone lavando as células três vezes em M-E-M-B-S-A.

Em seguida, transfira os citos para um meio de maturação contendo 10% de cultura de FBS. As células por 17 horas a 37 graus Celsius. Portanto, a meiose será retomada no dia seguinte.

Conserte os citos. Use aspiração de citos ou pipetagem bucal para mover rapidamente os diferentes grupos experimentais para poços de placas de quatro poços contendo 750 microlitros de PFA a 4% pré-aquecido. Deixe os citos incubarem por uma hora depois.

Lave cada grupo três vezes com 750 microlitros de PBS aquecido com 5% de FBS. Cada lavagem deve durar 15 minutos na incubadora após a lavagem, bloqueie cada grupo do local O em 5% FBS em BS. Deixe o bloqueio continuar durante a noite a quatro graus Celsius para imunocolorir. Use uma fileira de oito poços na placa de vários poços para cada grupo experimental de citos.

4 placas de 96 poços carregam 200 microlitros de solução por poço. Comece o processo de coloração com solução de anticorpo primário recém-preparada. Em seguida, cubra os poços com param e incube os citos de acordo com a especificação do anticorpo seguindo o anticorpo primário.

Lave os citos três vezes com 5% de FBS em PBS por 10 a 15 minutos por lavagem. Após três lavagens, transfira os citos para um poço de solução de anticorpos secundários. Cubra esses poços com paraforme.

Incube as células por uma hora a 37 graus Celsius e depois lave três vezes como antes. Depois de lavados, transfira os oócitos para lâminas de vidro limpas. Todos os oócitos de um grupo experimental são transferidos para uma única lâmina.

Aspire qualquer excesso de solução para imobilizar as células e adicione imediatamente oito microlitros de mídia de montagem contendo dappy. Em seguida, cubra, deslize-os cuidadosamente para evitar bolhas de ar ou danos aos citos Os citos foram micro injetados com um controle inespecífico ou perrin irna após 17 horas de cultura, a maioria dos controles atingiu o estágio metafásico dois e continha fusos mióticos organizados com cromossomos alinhados. A rotulagem Perrin mostrada em vermelho era brilhante e focada nos pólos do fuso.

Os transcritos foram derrubados com sucesso, pois a coloração de perrina nas células injetadas na irna não foi detectada. A maioria desses oócitos permaneceu na metáfase um e exibiu estruturas fusiformes desorganizadas com cromossomos desalinhados. Alguns progrediram para a metáfase dois, mas também exibiram fusos interrompidos.

Agora você deve ter uma boa compreensão de como coletar e micro injetar citos de camundongos com específicos como irna e, em seguida, corar imunologicamente esses citos para análise de fluorescência da formação e organização do spin. É importante lembrar de trabalhar rapidamente e com muito cuidado para preservar a viabilidade e a qualidade do osside.