ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

この実験の全体的な目標は、初期段階のゼブラフィッシュ胚から単一細胞を分離し、マイクロ流体ベースのシングルセルマルチプレックスシステムで捕捉して、個々の細胞の遺伝子発現を評価することです。この方法は、仕様化や分化中に細胞がどのような転写変化を受けるかなど、発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、従来の集団ベースの手法で隠されている不均一性を明らかにするための偏りのないアプローチであることです。

一般に、この手法に不慣れな人は、単一細胞の生存可能な調製物を生成することは技術的に困難ですが、下流の分析には不可欠であるため、苦労するでしょう。一度習得すると、ステップが適切に実行されれば、統合されたマイクロ流体チップ上で胚サンプル全体を単一の溶解細胞に処理することができます。この手順を試行する際には、マイクロ流体デバイス上で単一の細胞のみが捕捉されていることを確認することを忘れないでください。

成体の野生型およびトランスジェニックゼブラフィッシュを繁殖させた後、施設および機関が承認した標準操作手順に従って、15分間隔で胚を採取します。少なくとも2時間後、100〜300個の受精胚を1つの時点から新鮮な卵水を含む新しいシャーレに移します。また、細い鉗子を使用して、各胚から絨毛膜を手動で除去します。

次に、広口径ガラスピペットを使用して、最小量の卵水で胚を2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。すべての胚が移植されたら、水を1ミリリットルの氷冷卵水と交換し、チューブを氷に20分間沈めます。安楽死後、幅広のガラスピペットを使用して上清を取り除きます。

そして、胚に新鮮な卵水を2回加えるためのP-1000ピペット。2回目の洗浄後、卵水を1ミリリットルの脱卵液と交換し、P-1000ピペットを使用して、卵黄が溶解して胚の体のみが見えるようになるまで、胚を8〜12回粉砕します。遠心分離により組織を採取します。

次に、ピペットを使用して、組織ペレットを乱さずに上清を穏やかに除去し、細胞を1ミリリットルの新鮮な卵水に再懸濁します。胚をさらに2回洗浄した後、ペレットを1ミリリットルの室温細胞解離試薬-1に再懸濁します。次に、チューブを横にして置き、室温で10分間インキュベートします。

2〜3分ごとに優しくトリチュレーションを行い、凝集を防ぎます。インキュベーションの終了時に、細胞を再度スピンダウンし、ペレットを1ミリリットルの細胞解離試薬-2に再懸濁します。細胞を室温でさらに5〜15分間水平にインキュベートし、2〜3分ごとに穏やかにトリチュレーションします。

5分ごとに、2マイクロリットルの上清を18マイクロリットルのFACSバッファーで希釈し、細胞を液滴として細胞培養皿に分注します。サンプルの上にカバースリップを貼り、組織培養顕微鏡を使用して、10倍および20倍の倍率で消化の進行を評価します。調製物が主に単一細胞といくつかの小さな細胞クラスターと大きな細胞クラスター、およびいくつかのほとんど無傷の胚体との混合物であると思われる場合は、細胞をスピンダウンし、ペレットを1ミリリットルの冷たいFACSバッファーに再懸濁します。

次に、40ミクロンのセルストレーナーをFACSバッファーで濡らします。そして、ストレーナーを通して細胞をろ過し、35mmの細胞培養皿に入れます。細胞を再びスピンダウンした後、ペレットを100マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁し、トリパンブルー排除により生細胞の数をカウントします。

次に、サンプルを1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の5倍に希釈します。そして、未染色のコントロールのために細胞の10〜20%を予約します。残りの細胞を蛍光生死識別色素で染色します。

次に、35ミクロンのセルストレーナーでキャップされたFACSチューブを20マイクロリットルのFACSバッファーで濡らし、細胞をストレーナーに追加して、重力によってそれらを収集します。図示のゲーティング戦略を使用して、蛍光マーカーを発現する単一の生細胞を選別します。二重ラベルのセルでゲーティングを確認します。

対象集団の2, 000〜4, 000個の細胞を、氷上の微量遠心チューブ内の5マイクロリットルの冷たいFACS緩衝液に選別します。次に、選別した細胞の1マイクロリットルを、100マイクロリットルのFACSソーティングバッファーと1〜1,000希釈の生/死染色を備えた新しいFACSチューブに移します。そして、ソーティングゲートを使用して細胞サンプルを解析し、ソーティング後の生存率を評価します。

次に、9マイクロリットルのFACSバッファーで希釈した1マイクロリットルの細胞を血球計算盤にロードして、細胞濃度と平均直径を決定します。次に、サンプルの平均セル直径に適したサイズの集積マイクロ流体回路(IFCチップ)を選択し、製造元の指示に従って流路系をプライミングします。メーカーの指示に従ってセルをプレートにロードし、プレートを互換性のある流体マシンにロードします。

次に、IFCチップの適切なセルロードスクリプトを実行して、セルをキャプチャレーンにプッシュします。細胞が捕捉部位に留まっていることを確認するために、プレートアダプターを装備した顕微鏡にプレートを装着し、各捕捉部位の明視野および蛍光画像を10倍の倍率で取得します。その後、細胞をQRT-PCRによる標的遺伝子発現の下流評価のために処理できます。

18体節の段階では、蛍光顕微鏡を使用して胚のZsYellow発現を確認できます。選別後、さまざまな直径の細胞が得られます。IFCプレートは、目的の直径の細胞を捕捉するために使用できます。

例えば、この実験では、直径5〜10マイクロメートルの細胞です。予想通り、受精後18時間の胚から選別および捕捉された細胞は、ZsYellow蛍光マーカーを発現しました。ここでは、QRT-PCRを使用して、IFCプレート上の細胞捕捉部位から40個の単一細胞における目的の特定の遺伝子の相対的な遺伝子発現を評価しました。

ハウスキーピング遺伝子のサイクル閾値の範囲がサンプル間の遺伝子発現を比較するには広すぎ、多くのサイクル閾値が30を超えたため、値をヒートマップとして可視化した。サンプル間で比較すると、この実験では遺伝子発現にかなりの不均一性が観察されました。細胞は、遺伝子発現パターンに基づいてタイプ1から5

一度習得すると、ステップが適切に実行されれば、統合されたマイクロ流体チップ上で全胚サンプルを単一の溶解細胞に処理することができます。この手順を試みる際には、マイクロ流体チップ上には単一の細胞のみが捕捉されることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ハイスループットシングルセルシーケンシングなどの他の方法を実行して、シングルセルのトランスクリプトームを完全に特性評価することができます。

その開発後、この技術は、発生生物学の分野の研究者が初期発生胚の細胞の不均一性を調査するための道を開きました。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞を単離する方法、マイクロ流体ベースの単一細胞マルチプレックスシステムで単一細胞を捕捉する方法、個々の細胞の遺伝子発現を評価する方法について十分に理解できるはずです。