サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

ゼブラフィッシュ幼生サンプルを用いたこのRNASeq解析の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ胚および幼生の遺伝子発現プロファイルを特定し、サンプル間における遺伝子発現の変化について定量的な比較を行うことです。この手法は、特定の標的遺伝子の抑制が他の条件と比較してどのように遺伝子発現の変化や特定のパスウェイの破綻をもたらすかなど、ゼブラフィッシュの胚または幼生が有用であるあらゆる分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、ゼブラフィッシュが大量に生産可能であり、個体全体のトランスクリプトームデータを容易に取得できる点にあります。

さらに、トランスジェニック動物のソーティングを用いることで、特定の細胞型の分離を容易に行うことができます。手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるLain Hostelleyと、ポストドクターのJessica Nesmithが担当します。まず、胚を生殖成熟期である生後3ヶ月まで培養します。

胚採取の前日の夜に、目的の系統の成熟したオス2匹とメス3匹を、新鮮なシステム水が入った仕切り付きの交配タンクに分けて入れてください。翌朝、点灯後に仕切りを取り除き、タンクの底に胚が観察されるまで魚を自然交配させます。目的の数が集まるまで、胚を30分間隔で、胚培地を入れた個別のペトリ皿に回収してください。

胚のステージを判定するため、すべての胚の発達タイミングを一定にする目的で、10 cmのペトリ皿1枚あたり50〜75個のグループに分けて培養します。その後、プレートを28.5 °Cで保持します。分節化後、受精後約24時間（HPF）まで、体節数を用いて胚の日齢を測定し、発達段階に基づいて胚を分離します。

テキストプロトコルに従い、目的の段階で胚を安楽死させた後、20個の胚をまとめてラベル付きの1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。次に、マイクロ遠心チューブから過剰な胚培養液を除去します。チューブに200 microlitersの溶解試薬を加えます。

次に、乳棒を用いて胚を機械的にホモジナイズします。その後、溶解試薬をさらに 800 µL 加え、全量を 1 mL とします。RNA を抽出するために、回収したサンプルに溶解試薬を加え、室温で 5 分間インキュベートします。

使用した溶解試薬1 mLあたり0.2 mLのクロロホルムを加え、チューブを手で15秒間転倒混和させます。室温で2〜3分間インキュベートした後、12,000 ×g、4 °Cで15分間遠心分離します。分離した水層を新しいチューブに移し、使用した溶解試薬1 mLあたり0.5 mLのイソプロパノールを加えます。

チューブを室温で10分間インキュベートした後、サンプルを10分間遠心分離します。次に、RNAに75% ethanolを加え、7,500 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。上清を完全に除き、サンプルを室温で風乾させます。

その後、RNAを15～30 µLのDEPC処理水に再懸濁します。テキストプロトコルに従ってペレットを抽出し、サンプルを洗浄した後、高品質なRNAを精製するために、吸光光度計を用いて抽出したRNAの濃度と純度を測定します。シーケンシングリードの定量に基づくRNASeqおよび遺伝子発現変動解析のためにRNAサンプルをベンダーや企業に送付する前に、260/230比が約2.0であることを確認してください。

単一の実験条件とコントロールを比較するには、差分的発現遺伝子のデータを表計算ソフトで開きます。ソートボタンの隣にあるドロップダウン矢印を選択し、表計算ソフト内でカスタムソートを選択します。ポップアップウィンドウが表示されたら、「列」の下にあるボックスを選択し、LFC列でソートするように設定してください。

「列のソート」で「値」が選択されていることを確認します。「順序」列で、大きい順にソートするように選択し、「OK」をクリックします。2つの実験条件下で検出された発現変動遺伝子を特定するために、「実験群対対照群」のスプレッドシートで、空の列の最初のセルを選択します。

次に、セルに以下の数式を入力します。EnterキーまたはReturnキーを押して数式を実行してください。数式が入ったセルを選択し、セルの右下隅にあるボックスをクリックします。

マウスをクリックしたまま、選択範囲を列の最後までドラッグして最後のフィーチャーIDまで選択し、列の各セルに数式をコピーします。再度「カスタム並べ替え」を選択し、左下のプラスアイコンをクリックして2番目の並べ替えレベルを追加します。最初のレベルの「並べ替え」の「列」で、「duplicate」を選択します。

「並べ替えの基準」で「値」を選択し、「順序」で「ZからA」を選択します。第2レベルの「次に」の「列」で「LFC」を選択します。「並べ替えの基準」で「値」を、「順序」で「大きい順」を選択し、「OK」をクリックします。次に進む前に、遺伝子シンボルの列から括弧を削除するために、遺伝子シンボルが含まれる列全体を選択します。

ドロップダウンファイルメニューから「編集」を選択し、次に「置換」を選択します。置換ウィンドウの「検索する文字列」欄に、開き括弧、アスタリスク、閉じ括弧を入力し、「置換後の文字列」欄は空のままにします。「すべて置換」を選択して、すべての括弧を削除します。

濃縮経路を特定するために、目的の遺伝子シンボルをクリップボードにコピーします。ConsensusPathDBにアクセスし、ウェブページの左サイドバーにある「gene set analysis」を選択し、次に「over-representation analysis」を選択します。「paste a list of gene and protein identifiers」のボックスに、遺伝子リストを貼り付けます。

遺伝子/タンパク質識別子の種類のボックスでgene symbolを選択し、proceedをクリックします。pathway-based setsセクションで、pathway databasesによって定義されたpathwaysの隣にあるボックスを選択します。find enriched setsを選択すると、入力リストに含まれる遺伝子を含むパスウェイのリストが表示されます。

パスウェイ名の横にある各ボックスを選択するか、選択ボックス上の列ヘッダーにある「Select」の下の「All」をクリックして、パスウェイネットワークで可視化する濃縮パスウェイをすべて選択します。次に、「Visualize Selected Sets」を選択します。ページ上部中央にあるいずれかのボックスを選択し、希望するパーセント、相対的なオーバーラップ、または共有候補数を入力して、「Apply」を選択することで、相対的なオーバーラップおよび共有候補フィルターを調整します。

濃縮されたジーンオントロジーを決定するために、該当するグループの遺伝子シンボルをクリップボードにコピーします。Gene Ontology ConsortiumのGO Enrichment解析ツールにアクセスしてください。ページ左側の「your gene IDs here」の下にあるボックスに、遺伝子シンボルのリストを貼り付けます。

遺伝子IDボックスの下で、GO項目の「biological process（生物学的プロセス）」を選択します。次に、GO項目ボックスの下で「danio rerio」を選択し、submitをクリックします。テキストプロトコルに従ってQRT-PCRを行い、RNASeqの結果と比較します。

alms1またはbbs1に対するモルフォリノを注入した幼虫から抽出したRNAのシーケンシングにより、AlströmモデルおよびBBSモデルで特異的に発現が上昇または低下した遺伝子と、両モデルで有意に変動した遺伝子が明らかになりました。Alströmモデルの分子プロファイルをより明確に解明するため、差分的発現遺伝子において濃縮されているパスウェイおよびジーンオントロジーを特定しました。ここに示すように、合計31のパスウェイで発現の上昇が認められました。

代謝という広範なグループを除き、最も顕著に影響を受けた経路は自然免疫系および獲得免疫系であり、それぞれ32個および20個の遺伝子が関与していました。また、下流のB細胞受容体シグナル伝達イベントも濃縮されていました。さらに、発現が上昇した遺伝子群においていくつかのシグナル伝達経路が濃縮されており、これはアルストローム症候群と一次繊毛機能不全との関連性と一致しています。

さらに、インスリン分泌に関連する3つのパスウェイ（GPR40に結合する脂肪酸、遊離脂肪酸、およびアセチルコリン）がアップレギュレートされていました。最後に、Alstromモデルでアップレギュレートされた遺伝子において、赤血球分化、赤血球恒常性、骨髄系細胞恒常性、および恒常性維持プロセスを含む6つのGO用語が濃縮されていました。習得すれば、パスウェイ解析およびGO用語解析は1時間以内に完了させることができます。

この手順を行う際は、パスウェイパラメータおよびカットオフ値の選択が、RNASeq発現比較の結果を解釈する上で最も重要な検討事項であることを忘れないでください。本手順に続いて、変異株への適用や単一細胞型のトランスクリプトーム解析などの他の手法を実施することで、細胞型のトランスクリプトームプロファイリングや、特定の遺伝子の制御下にある遺伝子発現の変化など、さらなる疑問を解決することができます。このビデオを視聴することで、RNASeqによって生成されたゼブラフィッシュのトランスクリプトームデータを用いて、実験サンプル間における有意な遺伝子発現変化を特定する方法について、十分な理解を深めることができるはずです。