サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

ゼブラフィッシュの幼生サンプルにおけるこのRNASeq解析の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの胚と幼生の遺伝子発現プロファイルを特定し、サンプル間の遺伝子発現変化について定量的な比較ステートメントを作成することです。この方法は、ゼブラフィッシュの胚や幼虫が情報を提供するあらゆる分野で、例えば、1つの標的遺伝子の抑制がどのように遺伝子発現の変化を引き起こし、他の条件と比較して特定の経路が混乱するかなど、重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ゼブラフィッシュが多数の動物の生産に適しており、動物全体のトランスクリプトームデータを簡単に取得できることです。

さらに、トランスジェニック動物の選別を用いて、特定の細胞型の単離を容易に達成することができます。手順を実演するのは、大学院生のLain Hostelleyと、私の研究室のポスドクであるJessica Nesmithです。まず、胚を生後3ヶ月まで培養します。これは生殖成熟期です。

胚収集の前夜に、2匹の成魚と3匹の雌魚を所望の系統から淡水の分割交配タンクに分離します。翌朝、ライトが点灯したら、仕切りを取り外し、水槽の底で胚が観察されるまで魚が自然に交尾するのを待ちます。胚培地の別々のペトリ皿に30分間隔で胚を収集し、必要な数が収集されるまで胚

胚をステージングするには、10センチメートルのペトリ皿あたり50〜75のグループで胚を培養して、すべての胚の一貫した発生タイミングを促進します。次に、プレートを摂氏28.5度に保ちます。分節化後から受精後約24時間までの体節数(HPF)を用いて胚の年齢を測定し、発生年齢に基づいて胚を分離します。

テキストプロトコルに従って所望の段階で胚を安楽死させた後、20個の胚のプールを標識された1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。次に、余分な胚培地をマイクロ遠心チューブから取り出します。200マイクロリットルの溶解試薬をチューブに加えます。

そして、乳棒を使用して胚を機械的に均質化します。次に、さらに800マイクロリットルの溶解試薬を追加して、総容量を1ミリリットルにします。RNAを抽出するには、採取したサンプルに溶解試薬を添加し、室温で5分間インキュベー

溶解試薬1ミリリットルにつき0.2ミリリットルのクロロホルムを添加し、手でチューブを15秒間反転させます。サンプルを室温で2〜3分間インキュベートした後、サンプルを12,000倍のGおよび摂氏4度で15分間遠心分離します。分離した水相を新しいチューブに移し、使用する溶解試薬1ミリリットルごとに0.5ミリリットルのイソプロパノールを添加します。

チューブを室温で10分間インキュベートした後、サンプルを10分間遠心分離します。次に、RNAに75%エタノールを加え、チューブをGの7,500倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を完全に取り除き、サンプルを室温で風乾させます。

次に、RNAを15〜30マイクロリットルのDEPC処理水に再懸濁します。ペレットを抽出し、テキストプロトコルに従ってサンプルを洗浄した後、高品質のRNAを精製するには、吸収分光光度計を使用して抽出されたRNAの濃度と純度を分析します。260 over 230の値が約2.0であることを確認してから、RNAサンプルをベンダーまたはcorpsに送付し、RNASeqおよびシーケンシングリードの定量化に基づく遺伝子発現変化解析を行います。

単一の実験条件と対照条件を比較するには、スプレッドシート管理ソフトウェアで差次的に発現する遺伝子のデータを開きます。並べ替えボタンの横にあるドロップダウン矢印を選択し、スプレッドシート内のカスタム並べ替えを選択します。ポップアップするウィンドウで、列の下のボックスを選択し、LFC列で並べ替えることを選択します。

[並べ替え] 列で、[値] が選択されていることを確認します。[順序] 列で、最大から最小に並べ替えることを選択し、[OK] をクリックします。2つの実験条件で見つかった差次的に発現する遺伝子を決定するには、実験用スプレッドシートの1つと対照のスプレッドシートで、空の列の最初の細胞を選択します。

次に、次の方程式をセルに入力します。Enter キーまたは Return キーを押して、方程式を実行します。方程式を含むセルを選択し、セルの右下隅にあるボックスをクリックします。

マウスをクリックしたまま、選択した領域を列の一番下までドラッグして、最後のフィーチャ ID を選択して列の各セルに方程式をコピーします。カスタムソートを再度選択し、左下隅にあるプラスアイコンをクリックして、2番目のレベルのソートを追加します。最初のレベルで、並べ替えの基準で、列の下で、重複を選択します。

[並べ替え] で値を選択し、[順序] で [Z] を選択して 2 番目のレベルを A.In し、[列] で [LFC] を選択します。[並べ替え] で値を選択し、[順序] で [最大から最小] を選択して [OK] を選択します。先に進む前に遺伝子シンボル列から括弧を削除するには、遺伝子シンボルを含む列全体を選択します。

[編集]を選択し、ドロップダウンメニューで[置換]を選択します。左括弧、星形、閉じ括弧、置換ウィンドウのバーを見つけるに、空のバーと交換をリースします。括弧のすべてのインスタンスを削除するには、[すべて置換] を選択します。

濃縮された経路を決定するには、目的の遺伝子シンボルをクリップボードにコピーします。ConsensusPathDBに移動し、Webページの左側のサイドバーで遺伝子セット分析を選択し、続いて過剰表現分析を選択します。[paste a list of gene and protein identifiers] ボックスに、遺伝子のリストを貼り付けます。

[gene/protein identifier type]ボックスで遺伝子記号を選択し、[proceed]をクリックします。[pathway-based sets] セクションで、パスウェイデータベースで定義されたパスウェイの横にあるボックスを選択します。find enriched setsを選択して、入力リストに遺伝子を含むパスウェイのリストを取得します。

パスウェイネットワークで視覚化するエンリッチされたパスをすべて選択するには、パスウェイ名の横にある各ボックスを選択するか、選択ボックスの上にある列ヘッダーの選択ですべてをクリックします。次に、選択したセットの視覚化を選択します。相対的な重複と共有候補のフィルターを調整するには、ページの上部中央にあるいずれかのボックスを選択し、希望の割合、相対的な重複、または共有候補の数を入力してから、適用 を選択します。

濃縮された遺伝子オントロジーを決定するには、それぞれのグループの遺伝子シンボルをクリップボードにコピーします。Gene Ontology Consortium の GO Enrichment 解析ツールに移動します。ページの左側にある「ここの遺伝子IDs」の下に、遺伝子記号のリストをボックスに貼り付けます。

[gene IDS] ボックスの下で、go 用語、生物学的プロセスを選択します。次に、go termsボックスの下にあるdanio rerioを選択し、送信をクリックします。QRT PCRを実施し、テキストプロトコルに従ってRNASeqと比較します。

alms1またはbbs1に対してMorpholinosを注射した幼虫から抽出されたRNAのシーケンシングにより、AlstromモデルとBBSモデルで一意にアップレギュレーションとダウンレギュレーションされた遺伝子、および両方のモデルで有意に変更された遺伝子が明らかになりました。アルストロームモデルの分子プロファイルをより明確に解明するために、差次的に発現する遺伝子に富む経路と遺伝子オントロジーを同定しました。ここに示すように、合計31の経路がアップレギュレーションされました。

代謝の広範なグループ分けは別として、最も影響の大きい経路は自然免疫系と適応免疫系であり、それぞれ32と20の遺伝子がありました。下流のB細胞受容体シグナル伝達イベントも濃縮されました。また、アップレギュレーションされた遺伝子では、いくつかのシグナル伝達経路が濃縮されており、これはアルストロム症候群と原発性繊毛機能障害との関連と一致しています。

さらに、インスリン分泌に関連する3つの経路、GPR40に結合した脂肪酸、遊離脂肪酸、およびアセチルコリンがアップレギュレーションされました。最後に、Aldromモデルのアップレギュレーション遺伝子のうち、赤血球分化、赤血球恒常性、骨髄細胞恒常性、恒常性プロセスを含む6つのGO用語が濃縮されました。一度習得すれば、パスウェイとGOターム分析は1時間以内に行うことができます。

この手順を試行する際、RNASeq発現比較の結果を解釈する上で、パスウェイパラメータとカットオフ値の選択が最も重要な考慮事項であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、変異株による適用や単一細胞タイプのトランスクリプトーム解析などの他の方法を実行して、細胞タイプのトランスクリプトームプロファイリングや特定の遺伝子の制御下での遺伝子発現変化などの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、RNASeqによって生成されたゼブラフィッシュのトランスクリプトームデータを使用して、実験サンプル間の有意な遺伝子発現変化を同定する方法を十分に理解できるはずです。