Name: サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュのRNASeq解析手法。Danio rerioの胚や幼生からRNAを抽出し、遺伝子発現プロファイルを定量的に比較・解析する方法です。発生生物学や神経科学の研究に活用できます。

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<li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318(2016).</li>
</ol>

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このプロトコルで記述されているアプローチでは、全体の動物または特定のソートされた細胞集団のトランスクリプトーム レベル分析のため比較的迅速かつコスト効果の高い戦略を提供しています。ゼブラフィッシュのため使いやすさと出発物質、遺伝の実装の容易さや実験環境と大規模な可用性の大量の生成で、急速に研究のこのタイプの有利なモデルを提供します。細胞型の特定および組織固有の人口の分離を可能にする遺伝子改変レポーター線のスペクトル。
ここ詳細、一方このメソッドは簡単に FACs やコレクションの代わりとして青少年や成人の魚から収集した組織切片を収容できます。基本的なスプレッドシート コマンドと既存の経路と移動データベースの使用に依存する基本的な追跡調査解析戦略を構築しました。このアプローチの主な利点は、コンピューターのプログラミングやデータベースの管理に高度な専門知識を必要とせずユーザー補助の使いやすさです。そのため、この戦略は、大規模遺伝子発現データセットの有益な分析のためのすべての背景の調査官には適用です。
我々 のアプローチは、RNAS...

遺伝子発現の比較分析、観察された表現型に貢献する新規の遺伝子を識別するために貴重なツールです。そのような分析は通常トラン スクリプトの豊富な比較実験の定量的評価に依存し、サンプルを制御します。QRT PCR など、ターゲットを絞ったアプローチが比較的迅速かつ単一遺伝子発現変動の調査のため正確です。RNA シーケンス (RNASeq) ことが今このような調査のための標準実験システム間でサンプル間の遺伝子発現の重要な変更を識別するために広い、無料の仮説のアプローチを提供しています。
ゼブラフィッシュは、多くの病気の分野で著名なモデルとして浮上しています。もともと彼らの高い多産と比較的低コスト、メンテナンスのための発生生物学研究でのユーティリティ ゼブラフィッシュの実験的使用として同様の大人の段階に胚から表現の広い範囲を含むように進化している、1,2,3の試金の分子の広い配列。確かに、これらの利点は、分子機構の研究は急速な人生のすべての段階で遺伝と環境両方の操作のしやすさと材料の大きい量を獲得しやすいのためコスト効果の高い結合します。さらに、ゼブラフィッシュの胚・仔魚の透過的な性質作る離散セル人口4の生体内可視化を許可する細胞と組織特異遺伝子改変レポーター行を生成するために理想的。このような行の搾取レポーター遺伝子発現に基づく特定の孤立セル型グローバル遺伝子発現解析が可能です。
ゼブラフィッシュ胚の培養後 RNASeq を使用して世界的な遺伝子発現解析のための包括的なプロトコルをご紹介します。Morpholino (MO) を含む遺伝子の実験操作-ベースの一過的遺伝子ノックダウンや CRISPR を介したゲノム編集、提示されている他5,6,7。したがって、全体の胚からの RNA の隔離のための詳しいプロトコルに焦点を当てるまたは経路ツールと遺伝子の ontology (GO) の用語を使用して RNASeq 結果の簡単な解析に続いてトランスジェニック レポーター発現細胞を並べ替えられます。最後に、我々 は定量的逆転写 PCR (qRT PCR) による遺伝子発現変動の検証のための戦略を含まれています。これらのプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の遺伝的変異体または環境条件の比較を含む、実験の条件の広い範囲を受けるに適用されます。

<table><tbody><tr><td>市販試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Thermo Scientific</td><td>15596026</td><td>溶解試薬</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>解離バッファー 1</td></tr><tr><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>解離バッファー 2</td></tr><tr><td>DEPC 処理水</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>FirstStrand cDNA変換</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1621</td><td>cDNA変換キット</td></tr><tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qRT-PCR Master</td></tr><tr><td>Mix FACSバッファー</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong<></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40ミクロンセルストレーナー</td><td></td><td>Sigma CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>FACSチューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イルミナ HiSeq</td><td>イルミナ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライトサイクラー 480</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メイティングタンク 1.0L クロッシングタンクセット</td><td>アクアニアリング</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>FACSチューブ 5mLポリプロピレンチューブ</td><td>BDファルコン</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンセンサスパスDB</td><td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GO濃縮分析</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

サンプル準備およびゼブラフィッシュから rnaseq による遺伝子発現データの解析

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

グローバル遺伝子発現変動の解析は、観察された表現型の基になる新規経路を識別するための貴重なツールです。ゼブラフィッシュは動物の多数からの RNA の隔離のしやすさのため全体動物または個々 の細胞集団から全体のトランスクリプトームの迅速な評価の優れたモデルです。ここで RNA シーケンス (RNASeq) を用いたゼブラフィッシュ胚におけるグローバル遺伝子発現解析のためのプロトコルが表示されます。我々 は胚やトランスジェニック動物の細胞を用いての細胞集団から RNA の準備について説明します。濃縮経路と Gene Ontology (GO) 用語的遺伝子発現データセットを識別するために RNASeq データの解析のためのアプローチについて述べる。最後に、定量的逆転写 PCR (qRT PCR) を用いた遺伝子発現変動の検証のためのプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、新規遺伝子発現変動を識別するためにコントロールの比較分析およびゼブラフィッシュの実験セットを使用ことができ、興味の表現型への分子洞察力を提供します。

遺伝子を発現特異的の並べ替え。
ゼブラフィッシュ モデル Alström 症候群とバルデ-ビードル症候群 (BBS) の幼虫の段階で発現が異なる遺伝子を識別するためには、いずれかのalms1を対象としたまたは注入によってbbs1の成績証明書は以前に MOs のスプライス ブロックを検証野生型のゼブラフィッシュの胚の16,17。5 日目にポスト受精 (dpf) は、上記のセクション 3 で説明した、コントロール、MO 注入胚と同様に、それぞれの条件から抽出したの RNA の 2 つの複製。各サンプルからの RNA の深さに配列された 〜 の読み込み 1 億 2000 万 〜 1 億 700 万読み取りゼブラフィッシュ ゲノムへの配置。ゲノムの exonic 領域にマップされている一直線に並べられた読み取りの ...

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚は、幼虫から全体のトランスクリプトーム解析手法を提案またはセルを並べ替えられます。我々 には、RNA の隔離、RNASeq データの経路解析と遺伝子発現変動の qRT PCR による検証。

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

ゼブラフィッシュ幼生サンプルを用いたこのRNASeq解析の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ胚および幼生の遺伝子発現プロファイルを特定し、サンプル間における遺伝子発現の変化について定量的な比較を行うことです。この手法は、特定の標的遺伝子の抑制が他の条件と比較してどのように遺伝子発現の変化や特定のパスウェイの破綻をもたらすかなど、ゼブラフィッシュの胚または幼生が有用であるあらゆる分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、ゼブラフィッシュが大量に生産可能であり、個体全体のトランスクリプトームデータを容易に取得できる点にあります。さらに、トランスジェニック動物のソーティングを用いることで、特定の細胞型の分離を容易に行うことができます。手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるLain Hostelleyと、ポストドクターのJessica Nesmithが担当します。まず、胚を生殖成熟期である生後3ヶ月まで培養します。胚採取の前日の夜に、目的の系統の成熟したオス2匹とメス3匹を、新鮮なシステム水が入った仕切り付きの交配タンクに分けて入れてください。翌朝、点灯後に仕切りを取り除き、タンクの底に胚が観察されるまで魚を自然交配させます。目的の数が集まるまで、胚を30分間隔で、胚培地を入れた個別のペトリ皿に回収してください。胚のステージを判定するため、すべての胚の発達タイミングを一定にする目的で、10 cmのペトリ皿1枚あたり50〜75個のグループに分けて培養します。その後、プレートを28.5 °Cで保持します。分節化後、受精後約24時間（HPF）まで、体節数を用いて胚の日齢を測定し、発達段階に基づいて胚を分離します。テキストプロトコルに従い、目的の段階で胚を安楽死させた後、20個の胚をまとめてラベル付きの1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。次に、マイクロ遠心チューブから過剰な胚培養液を除去します。チューブに200 microlitersの溶解試薬を加えます。次に、乳棒を用いて胚を機械的にホモジナイズします。その後、溶解試薬をさらに 800 µL 加え、全量を 1 mL とします。RNA を抽出するために、回収したサンプルに溶解試薬を加え、室温で 5 分間インキュベートします。使用した溶解試薬1 mLあたり0.2 mLのクロロホルムを加え、チューブを手で15秒間転倒混和させます。室温で2〜3分間インキュベートした後、12,000 ×g、4 °Cで15分間遠心分離します。分離した水層を新しいチューブに移し、使用した溶解試薬1 mLあたり0.5 mLのイソプロパノールを加えます。チューブを室温で10分間インキュベートした後、サンプルを10分間遠心分離します。次に、RNAに75% ethanolを加え、7,500 ×g、

sample-preparation-analysis-rnaseq-based-gene-expression-data-from

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Genetics

遺伝学

高品質の単離は、インタクトなRNAは、多くの実験室のプロトコルで必須の工程である。ここで、我々は全体のゼブラフィッシュの胚と遺伝子発現のマイクロアレイ解析を含む様々な実験手順で、後続のアプリケーションのためのcDNA合成からのRNA抽出を示しています。...

遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcDNA合成からのRNA分離

遺伝子のマイクロアレイはゲノムワイドなレベルでの遺伝子発現プロファイリングの強力なツールです。この技術は、発生生物学や毒物学を含む生物学的な分野の様々なアプリケーションを持っています。このビデオでは、我々は詳細ゼブラフィッシュのための包括的なオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析用プロトコルを。...

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

この記事は、ゼブラフィッシュの胚を自然交配と選別によって生成するプロトコルについて説明しています。このプロトコルは、トランスジェニックフィッシュを使用した膵臓β細胞の分析にさらに使用されます。...

交配と卵のステージング:胚を生成し、発生段階ごとに選別する方法

ゼブラフィッシュの心臓発生中の心臓遺伝子発現プロファイルを分析するために、総RNAを単離した心臓から抽出されなければならない。ここでは、心臓特異的mRNAを得るために、ゼブラフィッシュの胚からの迅速な手動の切開によって、機能/鼓動心を収集するためのプロトコルを提示する。...

転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞を分離する方法、目的の細胞を濃縮する方法、マイクロ流体ベースの単一細胞マルチプレックスシステムでゼブラフィッシュ細胞を捕捉する方法、および単一細胞からの遺伝子発現を評価する方法を説明しています。...

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

ゼブラフィッシュは、開発中に DNA 複製タイミングを勉強する体内モデル システムとして最近使用されました。ここでは、プロファイル レプリケーション タイミングにゼブラフィッシュ胚を使用してのためのプロトコルの詳細。このプロトコルは、変異体、個々 の細胞の種類、病モデル、および他の種にレプリケーション...

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

ニューロン、マクロファージやミクログリア ゼブラフィッシュ稚魚の脳生理学的および病理学的条件の下でからを分離するためのプロトコルを提案します。分離時にこれらの細胞の遺伝子発現プロファイルを分析するから RNA を抽出します。このプロトコルは、qPCR とトランスクリプトミクスのような下流の分析を実行するため高品質の RNA...

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

その自然の病原体菌 marinumを使用して大人のゼブラフィッシュ モデルひと結核にプロトコルを紹介します。抽出された DNA と感染したゼブラフィッシュの内臓からの RNA は、抗酸菌の合計負荷魚と qPCR...

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋疾患で障害を受ける組織常駐筋幹細胞によって駆動され、筋肉が再生できないことが生じる。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生の検討を可能にするプロトコルについて述べる。...

ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

反応性求電子試薬および酸化剤を標的とするゼブラフィッシュ(Z-REX)は、反応性低分子シグナル伝達の調査のためのケミカルバイオロジーベースの方法です。この技術は、さまざまな発達段階の生きた魚に適用できます。ここでは、ゼブラフィッシュの標準アッセイとZ-REXを組み合わせてシグナル伝達経路を解析します。...

ゼブラフィッシュ仔魚のオンターゲットシグナル伝達応答のモニタリング - Z-REXは求電子薬と代謝物の正確なメカニズムを明らかにします

ここでは、ゼブラフィッシュの低存在量タンパク質の可視化に特に有用な、新たに開発および改変された in vivo...

ゼブラフィッシュの低発現タンパク質を可視化するための蛍光標識

学ぶゼブラフィッシュのRNASeq解析手法。Danio rerioの胚や幼生からRNAを抽出し、遺伝子発現プロファイルを定量的に比較・解析する方法です。発生生物学や神経科学の研究に活用できます。

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