Láser de Thulium de onda continua para calentar las células cultivadas para investigar los efectos térmicos celulares

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las respuestas biológicas celulares térmicas dependientes de la dosis in vitro mediante el calentamiento de células cultivadas con un control preciso de la temperatura y el tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos que investigan las respuestas celulares o tisulares a la hipertermia, como el estudio del tratamiento con láser de retina. La principal ventaja de esta técnica es un calentamiento rápido de las células y un control preciso sobre la duración del calentamiento, lo que permite una alta exposición térmica reproducible durante los experimentos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las respuestas de las células epiteliales pigmentarias de la retina cultivadas a la irradiación térmica con láser, también se puede aplicar a otros modelos, como las células cancerosas. Primero tuvimos la idea de este método al calentar células que contenían melanina con luz láser visible. Sin embargo, esto dio lugar a perfiles de temperatura variables debido a las variaciones en la pigmentación.

Para comenzar el procedimiento, coloque una placa calefactora en un soporte de laboratorio de metal ajustable sobre un banco limpio. Ajuste la placa calefactora a 39 grados centígrados. Fije una fibra de 0,22 NA con un diámetro de núcleo de 365 micrómetros al brazo horizontal del soporte.

Coloque el brazo metálico sobre la placa calefactora y ajuste el soporte de modo que la punta de la fibra quede 12 centímetros por encima de la placa calefactora. Conecte un láser de tulio de 1,94 micrómetros y 20 vatios con un haz de puntería de 365 nanómetros y un milivatio a la punta de la fibra. Coloque una placa de cultivo de 30 milímetros de diámetro en la placa caliente.

Traza cuidadosamente la circunferencia del plato en la superficie de la placa caliente y luego retira el plato. Encienda el haz de puntería y ajuste el soporte hasta que el centro del punto del haz en la placa calefactora coincida con el círculo trazado. A continuación, apague el haz de puntería.

Para comenzar el procedimiento de calibración de temperatura, caliente la punta de una aguja de calibre 20 con un mechero Bunsen. Con la punta de la aguja calentada, perfore el plato de cultivo de 30 milímetros de diámetro cerca del fondo en cuatro puntos separados por 90 grados para hacer agujeros de unos 300 micrómetros de diámetro. Coloca cinta aislante sobre los agujeros.

Use una aguja fina para perforar un orificio de aproximadamente 200 micrómetros de diámetro a través de la cinta que cubre cada orificio. En la parte inferior del plato de cultivo, dibuja una línea entre cada par de agujeros a 180 grados de distancia. Comenzando en la intersección de las líneas, marque cada tres milímetros radialmente a lo largo de cada línea para designar los 21 puntos de medición.

A continuación, coloque exactamente 1,2 mililitros de medio de cultivo fresco precalentado a 37 grados centígrados en el plato. Cubra el plato y colóquelo en el círculo trazado en la placa caliente. Conecte un termopar con un diámetro de 200 micrómetros a la computadora de control láser y abra el protocolo de calibración de temperatura.

Inserte el termopar en uno de los orificios del plato de modo que la punta quede en el fondo del plato en una de las ubicaciones de la marca. Es muy importante comprobar si la punta del termopar está tocando el fondo de la placa con la precisión medida porque la temperatura puede variar según la profundidad. Espere a que el medio de cultivo se estabilice a 37 grados centígrados.

A continuación, encienda el láser de tulio y ajuste la potencia del láser al nivel inicial deseado. Verifique que las duraciones de precalentamiento estén establecidas en 140 y ocho segundos y, a continuación, inicie la secuencia de irradiación de precalentamiento. Después de 140 segundos, según lo indique un pitido audible, retire inmediatamente la tapa de la placa de cultivo.

Espere hasta que finalice el precalentamiento y se produzca la irradiación de 10 segundos. A continuación, cubra inmediatamente el plato. Mida la temperatura en las ubicaciones de 21 marcas de esta manera.

Realice este procedimiento tres veces, cada una, a intervalos de potencia de tres vatios que abarquen el rango de potencia del láser. Una vez terminado, apague el láser de tulio. Exporte y analice los datos de temperatura.

Antes del experimento, se alquilaron células epiteliales pigmentarias en placas de cultivo de 30 diámetros. Mantenga los cultivos celulares a 37 grados centígrados en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y compruébelos utilizando un sistema de imágenes de células vivas. Una hora antes de la irradiación, reemplace el medio de cultivo en cada plato con exactamente 1,2 mililitros de medio de cultivo fresco.

Regrese los cultivos a la incubadora. Verifique que la estación de irradiación esté lista y que la placa calefactora esté configurada a 39 grados centígrados. Cuando esté listo para comenzar la irradiación, encienda el láser de tulio a la potencia deseada.

Abra el protocolo del experimento y compruebe que las duraciones de precalentamiento estén establecidas en 140 y ocho segundos. Coloque un cultivo celular de EPR en un plato cerrado en la posición marcada en la placa calefactora e inicie inmediatamente la secuencia de irradiación de precalentamiento de 140 y ocho segundos. Retire la tapa del plato después de 140 segundos de precalentamiento.

Espere hasta que finalice el precalentamiento y se produzca la irradiación de 10 segundos. Cubra inmediatamente el plato, espere siete segundos y luego devuelva el plato a la incubadora. Irradie muestras adicionales a niveles de potencia láser cada vez mayores.

Cuando termine, apague el láser de tulio. Para comenzar la evaluación de la viabilidad celular, lave las células irradiadas con PBS. Obtener un kit capaz de diferenciar células apoptóticas y necróticas vivas.

Luego, con poca luz, combine 500 microlitros de tampón aglutinante con 25 microlitros de homodímero de etidio-3, anexina FITC y Hoechst 33342. Incubar las células en esta solución de tinción a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, lave las células con tampón de unión 1X dos veces.

Reemplace el tampón de unión con PBS y coloque la célula en la platina de un microscopio de fluorescencia que tenga filtros DAPI, FITC y TRITC. Establezca la ruta de luz del microscopio en la lente ocular y seleccione el filtro DAPI. Encienda la luz de iluminación y encuentre el plano de enfoque con una lente de objetivo 4X.

Establezca la trayectoria de la luz en la cámara del microscopio. Utilice el software de imágenes de microscopio para centrar y enfocar la imagen. Defina los parámetros para la adquisición de imágenes mediante el filtro DAPI.

Repita el proceso de enfoque y la configuración de adquisición de imágenes con los filtros FITC y TRITC. A continuación, utilice el software de imágenes para adquirir varias imágenes con tres conjuntos de filtros en toda la placa y combinarlas en una sola imagen de toda la placa de cultivo. Utilice software analítico para determinar los umbrales de temperatura para la apoptosis y la muerte celular.

La relación proporcional entre el aumento máximo de temperatura en el centro de una placa de cultivo celular y la potencia del láser se determinó mediante el procedimiento de calibración térmica descrito. La distribución máxima de la temperatura a través de la placa de cultivo celular se ajustó a una función gaussiana. Se observaron tres patrones de tinción después de la irradiación.

No se observaron cambios en la viabilidad en cultivos sometidos a temperaturas iguales o inferiores a 43 grados centígrados. La apoptosis se observó por primera vez tres horas después de la irradiación a 47 grados centígrados. La muerte celular se observó más de tres horas después de los 51 grados centígrados o más.

A continuación, se determinaron las temperaturas umbral medias para la apoptosis y la muerte celular aplicando el promedio de los radios medidos de las áreas muertas y apoptóticas a la función gaussiana que describe la distribución de la temperatura. Siguiendo este procedimiento, las irradiaciones se pueden realizar en muchas condiciones diferentes, como diferentes perfiles de láser, tamaños de puntos y tiempos de irradiación. Esto puede ayudar a comprender e investigar preguntas relacionadas con las causas individuales de la temperatura temporizada a nivel celular.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo calentar el cultivo celular con un buen control sobre la temperatura y el tiempo. Esto puede depender de las posibilidades de estudiar las respuestas biológicas a diferentes condiciones de irradiación térmica. No olvides que trabajar con láseres puede ser muy peligroso para los ojos y la piel.

Manténgase informado sobre la capacitación en seguridad de irradiación láser. Siempre use gafas de seguridad, bata de laboratorio y guantes adecuados al realizar este procedimiento.