前根刺激のための斜め脊髄スライスの調製

この手順の全体的な目標は、腹側根の刺激を可能にする脊髄の斜めスライスを準備することです。この技術の主な利点は、腹側-根刺激のための運動神経同定を可能にし、運動神経軸索側副血縁によって活性化される腹側細胞を研究することができることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、腹側細胞を刺激する信頼性の高い方法が必要だったときでした。

この方法に不慣れな個人は、解剖のさまざまなステップを適切に実行するのが難しいため、苦労するでしょう。まず、P2からP11のマウスに低ナトリウムACSFを灌流します。マウスの首を切り落とし、背中の皮膚を取り除いた後、肩と胸郭に2つの切り込み

次に、脊髄を尾部のできるだけ低く切って、脊柱と肋骨を動物の下部から分離します。脊柱を裏返し、肋骨に付着したままの内臓を取り除きます。脊柱を別の小さなシリコン充填シャーレに移します。

冷たいACSFを加え、カルボゲンで泡立て、4本の昆虫ピンを使用して組織の背側を上に保持します。次に、まず細いハサミの先端を骨と脊髄の間に挿入し、白質を避けて吻側の端から骨を切開して、背側の椎弓切除術を行います。ピンセットを使用してすでに切り取られた骨のバンドを保持しながら、両側のカットを交互

次に、小さなピンセットを使用して硬膜を持ち上げ、小さなハサミを使用して両側の吻側尾側アクセスに沿って切断します。硬膜の除去は重要なステップです。これを徹底的に行うために、数分余分に費やす価値は十分にあります。

硬膜を取り外したら、鈍いガラスの先端を使用して、半分にカットされた脊柱によって形成された溝の左側に向かってコードをそっと押します。次に、腹側と背側の根を明るい側で、コードに入る場所からできるだけ遠くに切ります。左側で操作を繰り返し、常に吻側から尾側に進みます。

解剖後、脊髄を脊柱から滑り出します。次に、小さな昆虫ピンを使用して、背側表面のコードを固定します。付着したメンブレンの破片を繊細に取り除きます。

清掃したら、コードの両端を切り取り、曲がった昆虫ピンをコードの前部に挿入して、その向きをマークします。次に、脊髄を氷冷した細胞内溶液に移します。次に、前に準備した溶融寒天を氷と水の混合物で冷却します。

温度を測定しながら寒天をかき混ぜます。寒天の温度が摂氏38度に達したら、脊髄を虫ピンで保持し、吻側を下にして寒天に浸します。脊髄が壁から離れてできるだけまっすぐで、尾側が少し上を向いていることを確認してください。

ビーカーを氷と水の混合物に入れたままにして、寒天ができるだけ早くコードの周りで固まるようにします。固化後、ブロックの基部が脊髄の腰部に対して35度の角度になるように、脊髄を含む寒天ブロックを切断します。背側の表面は、ベースから反対側を向いている必要があります。

シアノアクリレート接着剤を使用して、ブロックをビブラトームのチャンバーに接着します。モータープールとそれらが出る腹側ルートとのモータープールの連続性を維持するために、ブロックを正しく取り付けることが重要です。ブロックをグルコン酸カリウム溶液に浸します。

ビブラトームのパラメータを設定します。次に、腰部の厚さ350,400ミクロンのスライスを切り取ります。これは、その曲率とより大きな直径で識別できます。適切なスライスを摂氏34度のACSFに移します。

通常、腹側根が2ミリメートル以上伸びる4〜5つの適切なスライスがあります。摂氏34度で約30分後、スライスを室温まで冷却し、録音セッションを開始します。先端径が40〜170ミクロンのさまざまなピペットの箱を事前に準備します。

セクションピペットを準備するには、長いタピュア付きのピペットを選択します。次に、ダイヤモンドナイフを使用して、さまざまな位置で切断を行い、解剖顕微鏡で、ピンセットで先端を叩いて各ピペットを壊します。次に、チャンバーを記録顕微鏡から取り外し、解剖顕微鏡の下に置きます。

吸引刺激電極に取り付けるのに十分な長さの腹側根を含むスライスを選択します。スライスをマウントし、腹側根を上に向けてから、腹側根の周りの寒天を繊細に切り取り、残りの寒天をスライスの周りに残し、サンプルを保持するためにグリッドを配置します。チャンバーを顕微鏡に取り付け直し、室温で毎分1〜2ミリリットルの速度で記録チャンバーにACSFを連続的に灌流します。

ACSFを充填し、シリンジに接続されたガラスピペットを使用して、腹根の1つを吸引します。腹側根を良好に刺激するためには、ピペットの先端を腹側根の周りでしっかりと閉める必要があります。目的の細胞タイプのパッチクランプ記録を達成し、前述のように腹側根刺激の効果を記録します。

この画像は、電圧クランプ記録の結果を示しています。上部パネルの記録は、下部パネルのものとは異なる運動ニューロンから取得されます。上のパネルは、1ボルトの刺激に対する運動ニューロンの抗ドロミック反応を赤で、5ボルトの刺激を黒で示しています。

下のトレースは、20ボルトの刺激に対するオルソドミックな活動電位の応答を赤で、30ボルトの刺激を黒で示しています。黒い点は刺激のタイミングを示します。二重の矢印は、オルソスパイクとアンチドロミックスパイクの待ち時間の違いを強調しています。

ここでは、電流クランプの記録を示します。上のパネルは、10ボルトと15ボルトの刺激に対する抗ドロミック反応をそれぞれ赤と黒で示しています。下のパネルは、25ボルトと40ボルトの刺激に対するオルソドローム反応をそれぞれ赤と黒で示しています。

ここでも、刺激のタイミングと待ち時間の違いが示されています。このRenshaw細胞プールの画像は、斜めのコンデンサーと20倍の対物レンズを使用して取得されました。矢印で示されているように、運動ニューロンの軸索が腹側ルートに合流していることに注意してください。

同じ領域のこの画像は、40倍の対物レンズを使用して撮影されました。推定されるレンショー細胞は、矢印の先端で示されています。ここに示されているのは、腹側ルートの刺激後のレンショー細胞の電圧クランプ記録であり、黒い点で示されています。

細胞内溶液中のQX-314は、細胞の発火を防ぎ、グリシンとGABAの応答は、それぞれ3マイクロモルのガバジンと1マイクロモルのストリキニーネによってブロックされました。赤いトレースは灰色のトレースの平均です。一度習得すると、このテクニックは20分または30分で実行できます。

この手順を試みるときは、常に準備を冷たい媒体に保管することを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、腹側ルート刺激に適した脊髄の斜めスライスを準備する方法をよく理解しているはずです。腹側-根刺激は、運動神経の同一性を簡単に確認するために使用でき、さらに重要なことに、腹側細胞を確実に刺激するために使用できます。