通过离心重力诱导脂肪源性干细胞的软骨分化

本实验的总体目标是诱导ASCs发生软骨向分化，以用于缺损软骨的修复。该方法利用离心重力诱导ASCs发生前软骨向分化。尽管该方法可为ASCs的软骨向分化提供研究依据，也可应用于其他体系，如成骨向分化和成纤维向分化。

该技术的主要优势在于，无需使用任何细胞因子处理，即可轻松诱导干细胞向软骨细胞分化。本实验操作将由我实验室的 Yeri Alice Rim 和 Yoojun Nam 演示。首先，弃去培养基，用 5 毫升 PBS 清洗，从一个 100 毫升培养皿中收集融合度达 80% 的脂肪源性干细胞。

然后，加入1 mL含有1 mM EDTA的PBS，于含5%二氧化碳的湿润培养箱中37摄氏度孵育2分钟。2分钟后，轻轻敲击培养板，加入4 mL新鲜培养基，将细胞转移至15 mL锥形管中。在室温下以250 × g离心2分钟。

离心后，小心移除上清液，切勿扰动沉淀。随后，将沉淀重悬于10毫升培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。

进行离心重力加载时，将2.5 × 10⁵个细胞转移至新的15毫升锥形管中，在2400 × g条件下离心15分钟。离心结束后，立即进行细胞沉淀或微团培养。离心完成后，迅速吸除上清液，并向细胞沉淀中加入500 µL软骨诱导分化培养基（CDM）以及50 µg/mL新鲜配制的L-抗坏血酸-2-磷酸。

阳性对照组，加入含有10纳克/毫升TGF-β-1的软骨诱导培养基（CDM）以诱导软骨向分化，并收集细胞。将离心管管盖松开，于含5%二氧化碳的湿润培养箱中37摄氏度培养三周。重力加载离心后立即吸除上清液，并将沉淀物重新悬浮于10微升CDM中。

为了形成微团，将重悬的细胞用移液器接种至24孔板中一个孔的中央，然后将培养板放入培养箱中。两小时后，小心地向孔中加入500 µL CDM，移液时沿培养板孔壁缓慢加入，以避免破坏微团结构。作为阳性对照，使用未经离心的细胞进行微团培养，加入含有10 ng/mL TGF-beta-1的CDM。

将微团培养三周。微团形成后的第21天，使用移液器收集球状体沉淀，然后用1×PBS洗涤。将球状体沉淀浸入4%多聚甲醛中固定24小时。

第二天，弃去固定液，用去离子水冲洗细胞沉淀。将一层纱布放入组织包埋盒中，用移液器将固定的球状体沉淀转移至纱布上。折叠纱布包裹住沉淀，并盖紧包埋盒盖子。

接下来，将球状体沉淀物在室温下浸入70%乙醇中5分钟以进行脱水。然后，依次通过一系列不同浓度的乙醇溶液，每种浓度处理5分钟。随后将沉淀物浸入100%二甲苯中15分钟。

将球状体沉淀物浸入56摄氏度的石蜡中进行包埋。随后，使用旋转式切片机从石蜡包埋的细胞沉淀物上切下5微米厚的切片。将切片漂浮于50%乙醇中，然后转移至50摄氏度的水浴中。

将漂浮的切片贴附到载玻片上，然后进行番红O和阿利新蓝的免疫荧光染色。为确定合适的离心重力，将ASC在0、300、600、1,200和2,400 ×g的离心重力下离心15分钟。在离心力刺激后24小时检测SOX9 mRNA的表达水平。

2,400 × g 的离心力显著诱导了 SOX9 mRNA 的表达。为评估软骨形成相关基因的表达，从未经刺激的 ASC、经离心处理的 ASC 或经 TGF-β1 处理的 ASC 中提取总 RNA。如图所示，离心力刺激可诱导 II 型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。

通过使用针对II型胶原的抗体及Alexa Fluor 594标记的二抗进行免疫荧光染色，证实了经CG处理的ASCs中II型胶原的过表达。为确定CG对软骨形成相关细胞外基质（ECM）过表达的影响，采用TGF-β1处理ASCs作为阳性对照。阴性对照为未接受CG加载或TGF-β1处理的细胞团块培养。

通过使用番红O和阿利新蓝染色法，评估了由离心后的ASC细胞形成的球状体中软骨形成相关细胞外基质（ECM）的过表达情况。糖胺聚糖是关节软骨的主要成分，可被阿利新蓝染成蓝色，或被番红O染成橙色。经过14天的微团培养后，通过聚集体的大小来评估软骨细胞的凝聚情况。

通过CG生成的每个聚集体大小约为0.5毫米。一旦掌握，若操作得当，该技术可在30分钟内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用离心重力诱导干细胞的软骨向分化。