פלואורסצנטיות של קרני רנטגן (XRF)

ראשית, יש להכין דגימות דקות, שטוחות ויבשות (אלא אם כן זמין שלב קריוגני מיוחד למיקרוסקופ). לאחר מכן, קרן רנטגן מונוכרומטית ממוקדת נסרקת על פני הדגימה. קרן הרנטגן מתגברת על האנרגיה המחייבת של חלק מאלקטרונים הקונכייה הפנימית לאטומי המתכת, וכאשר אלקטרונים מהמעטפת החיצונית נופלים לתוך המשרות הפנויות האלה, רנטגן שני נפלט על ידי המדגם. בכל נקודה בסריקת הרסטר הזו, ספקטרום פליטת פלואורסצנטיות של קרני רנטגן נאסף על ידי הגלאי.

בספקטרום זה, אורך הגל והעוצמה של כל צילומי הרנטגן הנפלטים על ידי המדגם נרשמים. בהתבסס על האנרגיה האופיינית (בשל המרווח של מסלולית באטום) של פלואורסצנטיות הנפלטת ואת העוצמה היחסית האופיינית של K_α ו K_β פסגות (למשל, אשר שניהם ידועים), ספקטרום הפליטה יכול לשמש כדי לקבוע הן את זהות המתכות הנוכחיות ואת הכמות.

וידאו זה יסביר את תהליך הכנת מדגם דק ויבש של תאים דבקים המתאימים להדמיית פלואורסצנטיות. תהליך הסריקה של הדגימות יוסבר בקצרה, ותמונה לדוגמה מתוארת.

1. הכנת חלונות הסיליקון ניטריד

1. השתמש פינצטה הפוכה כדי להרים חלון (חלונות ניטריד סיליקון יתנפץ אם ירד).
2. הנח חלון על מגלשת זכוכית, צד שטוח למעלה.
3. דבק חתיכות קטנות של סרט ויסקי לצדי החלון, ולהשתמש אלה כדי לדבוק את החלונות לתחתית צלחת התרבות.
4. לחטא את החלונות בצלחות תרבות עם קרינת UV. זה יכול להתבצע עם הגדרת crosslink אוטומטי על ארון UV-crosslinking, ואחריו הקרנת UV נוספת תחת מנורת UV במכסה המנוע זרימה למינאר במשך כ 1 שעות.

2. ציפוי התאים על חלונות הסיליקון ניטריד המעוקרים

1. החזק את המנה עם זה מוטה על זווית 45°.
2. הוסף מדיה על ידי צנרת לכיוון הצד של המנה לאט להקל על זווית ההטיה כדי לצפות את החלון עם מדיה.
3. מוסיפים תאים לצלחת התרבות, באותו אופן, ודגרה.
4. התבונן בתאים מדי פעם באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לקבוע מתי הם מוכנים לשימוש.

3. קיבעון וייבוש של תאים

1. במכסה המנוע של זרימה למינארית, הסר את המדיה על ידי שאיפה עדינה תוך הטיית המנה כמתואר לעיל.
2. מוסיפים PBS, צינורות לכיוון הצד של המנה תוך החזקת אותו בזווית. יש להקל באיטיות על זווית ההטיה כדי לצפות את החלון ב-PBS.
3. הסר PBS עם שאיפה עדינה.
4. צנרת לכיוון הצד של המנה, והחזקתה בזווית, להוסיף 4% PFA / PBS, pH 7 כדי לכסות את התאים. שמור בתמיסה זו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הסר את תערובת PFA / PBS, ולהיפטר כחומר מסוכן.
6. הוסף PBS, pipetting כמתואר לעיל.
7. חזור על שלבים 3.5 ו-3.6 פעמיים.
8. הסר את PBS על ידי שאיפה עדינה.
9. הוסף צינורות 20 מ"מ, 200 mM סוכרוז, pH 7.
10. הסר את צינורות / סוכרוז על ידי שאיפה עדינה.
11. חזור על שלבים 2.8 ו- 2.9 פעמיים.
12. כתם במהירות את הקצוות ואת הכניסה האחורית של החלון עם Kimwipe, ולאחר מכן להגדיר את החלון על משטח נקי, כגון מחצלת רשת גומי, להתייבש.

4. הדמיית פלואורסצנטיות של תאים

1. לאחר הדגימה יבשה, לאמת את נוכחותם של תאים על החלונות באמצעות מיקרוסקופ אור.
2. השתמש בלק כדי לאבטח את החלונות למחזיק אלומיניום המסופק על ידי קו הקורה.
3. הכנס את מחזיק האלומיניום להרכבה קינמטית, ולאחר מכן מקם אותו בעמדה בנקודת המוקד של האופטיקה במיקרוסקופ קרני הרנטגן, ובזווית של כ -45° לקרן הרנטגן של האירוע, מותקן על שלבי הננו-מיקום לדוגמה.
4. צא מאזור מכשיר המיקרוסקופ של קרני הרנטגן (בדרך כלל כלוב עשוי קירות עופרת), ופתח את התריס. נהל את השלבים הנותרים מרחוק.
5. באמצעות לוחית אזור, או מראות קירקפטריק-באאז, למקד את קרן הרנטגן המונוכרומטית (בדרך כלל 10 keV באנרגיה) עד לגודל ספוט תת מיקרון.
6. באמצעות שלבי דגימת הננו-מיקום, והצגת המיקום של קרן הרנטגן במדגם באמצעות מצלמת נצנצים מכוילת מראש במורד הזרם, לקבוע את הרוחב והגובה המתאימים של סריקת הרסטר כדי ללכוד נתונים של המדגם.
7. עם גלאי נדידת סיליקון באורך גל ב 90° לקרן האירוע, וכ -3 מ"מ או פחות מהדגימה, לאסוף ספקטרום בדיקה עם זמן התעכבות של 1-2 שניות.
8. הצגת ספקטרום הבדיקה, בחר זמן התעכבות מתאים לסריקה, כדי לספק אות לרעש מספיק עבור האלמנטים המעניינים.
9. בחר רזולוציה מתאימה לסריקה, כזו שאינה קטנה משמעותית מגודל הספוט של הקרן במדגם, ואינה גדולה יותר מתכונות העניין במדגם.
10. תכנת את הסריקה לתוך תוכנת הסריקה ואסוף את התמונה.

מפת הפלואורסצנטיות של קרני הרנטגן של תא דבק מוצגת באיור 1. כל פאנל מציג את ההתפלגות של אלמנט מסוים (למשל, נחושת, ברזל, אבץ וכו ') מעל התא. הפאנל שכותרתו 's_a' מראה את ספיגת צילומי הרנטגן.

איור 1. מפת פלואורסצנטיות של רנטגן של תא חסיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הדמיית פלואורסצנטיות של קרני רנטגן יכולה להיות כלי שימושי בתחומים רבים, כולל מדעי הגיאוגרפיה, מדע זיהוי פלילי, מדעי החומרים, הביולוגיה ואפילו בחקר המורשת התרבותית שלנו. במדעי החומרים, זה יכול לעזור למצוא פגמים שבבים וזרזים שנעשו עם מתכות. בעבודת מורשת תרבותית, הוא שימש לזיהוי מתכות רעילות בשיערם של אנשים מתים מפורסמים (למשל, בטהובן), ולזיהוי מקור הצבעים המשמשים באמנות. בביולוגיה, הוא משמש כדי ללמוד את המתכות הטבעיות המבצעות ביוכימיה חשובה. ב- geosciences, הוא משמש לעתים קרובות כדי לחקור אירועים המתועדים בשיא הסלע. שני מאפיינים מסוימים שהופכים הדמיית פלואורסצנטיות של קרני רנטגן לשימושית בתחומים רבים כל כך הם 1) הפריטים הלא הרסניים שלה, כל כך הרבה פריטים נדירים, או בעלי ערך גבוה ניתן לדמיין, ו -2) בעוד הכנת המדגם המתוארת כאן לתאים היא מורכבת - מכיוון שהתאים חייבים להיות מיובשים עבור חומרים רבים כגון סלעים, אמנות או פריטים אחרים, יש מעט מאוד הכנת מדגם נדרש, מלבד זה צריך להיות שטוח ללא אבק. למרות סינכרוטרון נדרש אשר הגישה הטובה ביותר באמצעות שיתוף פעולה עם מדענים במתקנים אלה, הטכניקה יכולה להיות נגישה מאוד.