Overview
Fonte: Laboratório da Dra.
Fluorescência de raios-X é uma radiação induzida e emitida que pode ser usada para gerar informações espectroscópicas. A microscopia de fluorescência de raios-X é uma técnica de imagem não destrutiva que usa a emissão de fluorescência induzida de metais para identificar e quantificar sua distribuição espacial.
Principles
Primeiro, devem ser preparadas amostras finas, planas e secas (a menos que um estágio criogênico especial esteja disponível para o microscópio). Em seguida, um feixe de raio-X monocromático focado é escaneado rasterizado através da amostra. O feixe de raios-X supera a energia de ligação de alguns dos elétrons da camada interna aos átomos metálicos, e quando elétrons de camada externa caem nessas vagas, um segundo raio-X é emitido pela amostra. Em cada ponto deste raster-scan, um espectro de emissão de fluorescência de raios-X é coletado pelo detector.
Neste espectro, é registrado o comprimento de onda e intensidade de todos os raios-X emitidos pela amostra. Com base na energia característica (devido ao espaçamento dos orbitais no átomo) da fluorescência emitida e na intensidade relativa característica dos picos Kα e Kβ (por exemplo, ambos conhecidos), o espectro de emissões pode ser usado para determinar tanto a identidade dos metais presentes quanto a quantidade.
Este vídeo explicará o processo de preparação de uma amostra fina e seca de células aderentes adequadas para a imagem de fluorescência. O processo de digitalização das amostras será explicado brevemente, e uma imagem de exemplo descrita.
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Procedure
1. Preparando as janelas de nitreto de silício
- Use pinças inversas para pegar uma janela (janelas de nitreto de silício se quebrarão se cairem).
- Coloque a janela em um deslizamento de vidro, lado plano para cima.
- Adere pequenos pedaços de fita adesiva aos lados da janela, e use-os para aderir as janelas ao fundo do prato de cultura.
- Esterilize as janelas em pratos de cultura com radiação UV. Isso pode ser feito com a configuração de auto-crosslink em um gabinete UV-crosslinking, seguido de mais irradiação UV sob a lâmpada UV no capô de fluxo laminar por cerca de 1 h.
2. Emplacando as células nas janelas de nitreto de silício esterilizado
- Segure o prato com ele inclinado em cerca de um ângulo de 45°.
- Adicione mídia ao pipetar em direção ao lado do prato e lentamente alivie o ângulo de inclinação para revestir a janela com mídia.
- Adicione células ao prato de cultura, da mesma forma, e incubar.
- Observe as células ocasionalmente usando um microscópio leve para determinar quando elas estão prontas para uso.
3. Fixação e Secagem de Células
- Em um capô de fluxo laminar, remova a mídia por aspiração suave enquanto inclina o prato como descrito acima.
- Adicione PBS, pipetando em direção ao lado do prato enquanto segura-o no ângulo. Alivie lentamente o ângulo de inclinação para revestir a janela com PBS.
- Remova o PBS com aspiração suave.
- Pipetando em direção ao lado do prato, e segurando-o em um ângulo, adicione 4% PFA/PBS, pH 7 para cobrir as células. Mantenha nesta solução por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Remova a mistura PFA/PBS e descarte como material perigoso.
- Adicione PBS, pipetando conforme descrito acima.
- Repita as etapas 3.5 e 3.6 duas vezes.
- Remova o PBS por aspiração suave.
- Adicione 20 mM PIPES, 200 mM de sacarose, pH 7.
- Remova o PIPES/sacarose por aspiração suave.
- Repita as etapas 2.8 e 2.9 duas vezes.
- Limpe rapidamente as bordas e o recuo da janela com um Kimwipe, em seguida, coloque a janela em uma superfície limpa, como um tapete de grade de borracha, para secar.
4. Imagem de Fluorescência de Raios-X das Células
- Uma vez que a amostra esteja seca, verifique a presença de células nas janelas usando um microscópio leve.
- Use esmalte para fixar as janelas em um suporte de alumínio fornecido pela linha de vigas.
- Insira o suporte de alumínio em um suporte cinemático e, em seguida, coloque-o em posição no ponto focal da óptica no microscópio de raios-X, e em um ângulo de cerca de 45° para o feixe de raios-X incidente, montado para os estágios de nanoposicionamento da amostra.
- Saia da área do instrumento do microscópio de raios-X (geralmente uma cabana feita de paredes de chumbo) e abra o obturador. Conduza as etapas restantes remotamente.
- Usando uma placa de zona, ou espelhos Kirkpatrick-Baez, concentre o feixe de raios-X monocromático (geralmente 10 keV em energia) até um tamanho de ponto de sub-mícnico.
- Usando os estágios da amostra de nanoposicionamento e visualizando a posição do feixe de raios-X na amostra com uma câmera cintilante pré-calibrada a jusante, determine a largura e altura apropriadas do raster scan para capturar dados da amostra.
- Com o detector de deriva de silício dispersivo de comprimento de onda a 90° para o feixe de incidente, e cerca de 3 mm ou menos da amostra, colete um espectro de teste com um tempo de 1 a 2 segundos.
- Visualizando o espectro de teste, escolha um tempo de moradia adequado para a varredura, para fornecer sinal-a-ruído suficiente para os elementos de interesse.
- Escolha uma resolução apropriada para a digitalização, que não seja significativamente menor do que o tamanho do feixe na amostra, nem maior do que as características de interesse da amostra.
- Programe a varredura no software de digitalização e colete a imagem.
Fluorescência de raios-X, ou XRF, espectroscopia é uma técnica analítica não destrutiva que é usada para realizar análise elementar de amostras à temperatura ambiente.
O XRF pode ser aplicado a uma ampla gama de amostras, incluindo obras biológicas, forenses, ambientais e até mesmo obras de arte. As amostras também podem tomar uma variedade de formas, como pós, cristais e líquidos. Em XRF, uma amostra é bombardeada com um feixe de raios-X fazendo com que emita raios-X secundários a uma energia mais baixa, que são chamadas de radiação fluorescente.
Embora seja referido como uma técnica de fluorescência, o XRF difere da microscopia tradicional de fluorescência, na medida em que não usa luz visível de menor energia, ou moléculas ativas da luz.
Este vídeo introduzirá o básico do XRF e demonstrará como coletar mapas elementares de uma amostra biológica.
Quando um fóton de energia suficiente colide com um átomo, a energia é absorvida, excitando um dos elétrons da camada externa. À medida que o elétron relaxa, ele emite um fóton secundário, tipicamente de menor energia. Este processo é conhecido como fluorescência. Ao contrário dos fótons de baixa energia, como os usados na microscopia de fluorescência, os fótons de raios-X são energéticos o suficiente para expulsar completamente elétrons firmemente retidos de uma concha interna. Um elétron de uma camada de energia alta cairá na vaga. Um fóton proporcional à diferença de energia entre as duas conchas é liberado. Cada elemento emite um conjunto único de fótons, ou espectro, que pode ser usado para identificar o elemento e determinar a quantidade presente. Este fenômeno é conhecido como fluorescência de raios-X.
Uma vez coletado um espectro elementar, os sinais de elementos de interesse podem ser isolados. Medições podem ser tomadas em vários locais através de uma amostra, gerando uma imagem, um pixel de cada vez. Este processo é conhecido como varredura raster. Imagens de todos os elementos de interesse podem ser posteriormente geradas. Esses mapas elementares fornecem informações valiosas sobre a amostra. Com a compreensão do XRF, agora você está pronto para preparar uma amostra de células biológicas para gerar mapas elementares.
Para começar, primeiro prepare e esterilize uma janela de nitreto de silício, que manterá a amostra no lugar para a varredura. Use o cuidado, pois eles são muito frágeis. Oriente a janela para que fique de lado plano para cima. Em seguida, coloque a janela em um prato de cultura, e adere ao prato usando pequenos pedaços de fita adesiva.
Por fim, esterilize a janela de nitreto de silício com radiação UV por 1 hora.
Agora que a janela foi esterilizada, a amostra pode ser fixada a ela. Primeiro, segure o prato de cultura em um ângulo e adicione mídia ao lado do prato. Alivie lentamente a inclinação para revestir a janela. Adicione células ao prato da mesma maneira e incubar.
Observe periodicamente as células sob um microscópio leve até que estejam prontas para uso.
Em um capô de fluxo laminar, aspire suavemente a mídia do prato.
Em seguida, enxágue as células com soro fisiológico tamponado de fosfato para remover o excesso de mídia.
Aspire o PBS, e fixe as células com paraformaldeído. Após 20 min, retire a mistura e descarte como resíduos perigosos.
Remova a janela do prato, e rapidamente limpe as bordas e volte o recuo da janela com um Kimwipe. Coloque a janela em uma superfície limpa para secar.
Uma vez que a amostra esteja seca, verifique a presença de células na janela com um microscópio leve.
Usando esmalte transparente, fixe a janela em um suporte de alumínio.
Insira o suporte da amostra no suporte do instrumento e coloque a montagem no estágio de posicionamento dos microscópios de raios-X.
Posicione a janela amostral no ponto focal da óptica do microscópio de raios-X, com um ângulo de 45 graus no feixe de incidentes.
Saia da área do instrumento e conduza as etapas restantes remotamente para minimizar a exposição a raios-X.
Abra o obturador e use óptica para concentrar o feixe de raios-X monocromático até um tamanho de ponto de sub micrômetro.
A posição do local pode ser visualizada com uma câmera pré-calibrada. Utilizando os estágios de posicionamento, determine a largura e altura adequadas para rasterar sobre a amostra.
Colete um espectro de teste do elemento de interesse com um tempo de moradia de 1 a 2 segundos.
A partir do espectro de teste, escolha um tempo de varredura adequado para fornecer uma relação sinal-ruído suficiente para os elementos de interesse.
Em seguida, determine a resolução necessária para a amostra. A resolução deve ser menor do que as características de interesse, mas maior do que o tamanho do local. Finalmente, programe a varredura no software de digitalização e colete a imagem.
Neste experimento, um mapa elementar de uma célula foi realizado para vários elementos diferentes. Muitos metais, como cobre, ferro e zinco são nutrientes importantes na célula, e foram claramente identificados dentro da célula.
Ao determinar onde cada metal é encontrado na célula, informações valiosas podem ser elucidadas sobre seus processos celulares normais. Além disso, doenças à base de metal podem ser entendidas.
Fluorescência de raios-X é usada em uma ampla gama de campos científicos. A natureza não destrutiva do XRF permite seu uso no estudo de artefatos históricos. Historiadores de arte utilizam a técnica para determinar os pigmentos originalmente usados em obras de arte. Isso pode elucidar informações sobre o trabalho, como a procedência, cores que desapareceram ao longo do tempo e a autenticidade. Cientistas forenses também usam XRF na investigação da cena do crime. Quando uma arma é disparada, a área circundante é revestida com resíduo de tiro de arma. O resíduo de tiro de arma contém pólvora, primer de ignição e metal do invólucro e bala. As informações coletadas com xrf podem identificar o culpado e a arma usada.
Outro campo de estudo que se presta à fluorescência de raios-X é a paleontologia. Aqui, informações elementares são coletadas de um fóssil trilobita, um artrópode marinho que viveu há mais de 250 milhões de anos.
Ao caracterizar a composição elementar dos fósseis, novas informações podem ser obtidas sobre a longa vida extinta. Amostras mais bem preservadas podem até fornecer a composição de tecidos moles que se deterioraram há muito tempo.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à fluorescência de raios-X. Agora você deve entender a teoria da espectroscopia de raios-X e como coletar informações elementares de uma ampla gama de fontes.
Obrigado por assistir!
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Results
O mapa de fluorescência de raios-X de uma célula aderente é mostrado na Figura 1. Cada painel mostra a distribuição de um determinado elemento (por exemplo, cobre, ferro, zinco, etc) sobre a célula. O painel intitulado "s_a" mostra a absorção de raios-X.
Figura 1. Mapa de fluorescência de raios-X de uma célula aderente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Applications and Summary
A imagem de fluorescência de raios-X pode ser uma ferramenta útil em muitos campos, incluindo geociências, ciência forense, ciência dos materiais, biologia e até mesmo no estudo de nosso patrimônio cultural. Na ciência dos materiais, pode ajudar a encontrar defeitos em chips e catalisadores feitos com metais. No trabalho do patrimônio cultural, tem sido usado para identificar metais venenosos nos cabelos de pessoas mortas famosas (por exemplo, Beethoven), e para identificar a fonte de tintas usadas na arte. Em biologia, é usado para estudar os metais naturais que realizam importantes bioquímicas. Em geociências, é frequentemente usado para estudar eventos narrados no disco de rock. Duas características particulares que tornam a imagem de fluorescência de raios-X útil em tantos campos são 1) suas não destrutivas, tantos itens que são raros, ou de alto valor podem ser imagens, e 2) enquanto a preparação da amostra descrita aqui para células é complexa — porque as células devem ser secas para muitos materiais, como rochas, arte ou outros itens, há muito pouca preparação amostral necessária, além de ser plana e livre de poeira. Embora seja necessário um síncrotron que seja melhor acessado através da colaboração com cientistas nessas instalações, a técnica pode ser muito acessível.
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