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엑스레이 형광 (XRF)

Overview

출처: 리디아 피니 박사 연구소 — 아르곤 국립 연구소

X선 형광은 분광 정보를 생성하는 데 사용할 수 있는 유도된 방출 방사선이다. X선 형광 현미경 검사는 금속의 유도된 형광 방출을 사용하여 공간 분포를 식별하고 정량화하는 비파괴 이미징 기술입니다.

Principles

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첫째, 샘플은 얇고 평평하며 건조한 샘플을 준비해야 합니다(현미경에 특수 극저온 단계가 제공되지 않는 한). 다음으로, 집중된 단색 X선 빔이 샘플 을 가로질러 래스터 스캔됩니다. X선 빔은 금속 원자에 대한 내부 쉘 전자의 일부 의 결합 에너지를 극복하고 외부 쉘 전자가 그 공석에 빠지면 샘플에 의해 두 번째 X 선이 방출됩니다. 이 래스터 스캔의 모든 지점에서 X 선 형광 방출 스펙트럼은 검출기에 의해 수집됩니다.

이 스펙트럼에서, 샘플에 의해 방출되는 모든 X선의 파장 및 강도가 기록된다. 방출된 형광의 특성 에너지(원자내 궤도의 간격)와 Kα 및 Kβ 피크의 특징적인 상대강도(예를 들어, 둘 다 공지됨)에 기초하여, 방출 스펙트럼은 존재하는 금속의 정체성과 수량을 모두 결정하는 데 사용될 수 있다.

이 비디오는 형광 화상 진찰에 적합한 응신 세포의 얇고 건조한 견본을 준비하는 과정을 설명할 것입니다. 샘플을 스캔하는 과정은 간략하게 설명되고, 예를 설명한 이미지.

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Procedure

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1. 실리콘 니타드 윈도우 준비

  1. 역 핀셋을 사용하여 창을 선택합니다 (떨어지면 실리콘 질화물 창이 산산조각 날 것입니다).
  2. 창을 유리 슬라이드에 놓고 평평한 면을 위로 놓습니다.
  3. 작은 조각의 스카치 테이프를 창 의 측면에 부착하고 문화 접시의 바닥에 창문을 부착하는 데 사용합니다.
  4. UV 방사선으로 문화 요리의 창문을 살균하십시오. 이는 UV 크로스링크 캐비닛의 자동 크로스링크 설정과 함께 수행할 수 있으며, 그 다음에는 라미나르 유동 후드의 UV 램프 아래에서 약 1시간 동안 UV 조사를 수행할 수 있습니다.

2. 멸균 실리콘 Nitride 창에 세포를 도금

  1. 약 45° 각도로 기울어진 접시를 잡습니다.
  2. 접시의 측면을 향해 파이펫으로 미디어를 추가하고 천천히 미디어로 창을 코팅하는 기울기 각도를 완화합니다.
  3. 같은 방식으로 배양 접시에 세포를 추가하고 배양합니다.
  4. 때때로 가벼운 현미경을 사용하여 세포를 관찰하여 언제 사용할 준비가 되었는지 확인합니다.

3. 셀의 고정 및 건조

  1. 라미나르 플로우 후드에서 위에서 설명한 대로 접시를 기울이면서 부드러운 포부로 미디어를 제거합니다.
  2. PBS를 추가하여 접시 의 측면을 향해 파이프를 넣고 비스듬히 유지합니다. 천천히 PBS로 창을 코팅하는 기울기 각도를 완화.
  3. 부드러운 포부로 PBS를 제거하십시오.
  4. 접시의 측면을 향해 파이프팅하고, 비스듬히 잡고, 세포를 커버하기 위해 4 % PFA / PBS, pH 7을 추가합니다. 실온에서 20 분 동안이 솔루션을 유지하십시오.
  5. PFA/PBS 혼합물을 제거하고 유해 물질로 폐기하십시오.
  6. 위에서 설명한 대로 PBS를 추가합니다.
  7. 3.5 및 3.6 단계를 두 번 반복합니다.
  8. 부드러운 포부로 PBS를 제거하십시오.
  9. 20mM 파이프, 200mM 자당, pH 7을 추가합니다.
  10. 부드러운 포부로 파이프/자당을 제거합니다.
  11. 2.8 및 2.9 단계를 두 번 반복합니다.
  12. 김스 와이프와 함께 창의 가장자리와 다시 들여 쓰기를 신속하게 블롯 한 다음 고무 그리드 매트와 같은 깨끗한 표면에 창을 설정하여 건조시합니다.

4. 세포의 엑스레이 형광 화상 진찰

  1. 샘플이 건조되면 가벼운 현미경을 사용하여 창에 셀의 존재를 확인합니다.
  2. 매니큐어를 사용하여 빔라인에서 제공하는 알루미늄 홀더에 창문을 고정시하십시오.
  3. 알루미늄 홀더를 운동마운트에 삽입한 다음 X선 현미경의 광학 초점지점에 배치하고, 약 45°의 각도로 시료 나노위치 단계에 장착된 X선 빔에 배치한다.
  4. X선 현미경 기기 영역(일반적으로 납 벽으로 만든 오두막)을 종료하고 셔터를 엽니다. 나머지 단계를 원격으로 수행합니다.
  5. 존 플레이트 또는 Kirkpatrick-Baez 거울을 사용하여 단색 X선 빔(일반적으로 에너지 10keV)을 하위 미크론 스팟 크기로 집중합니다.
  6. 나노위치 샘플 단계를 사용하고, 미리 보정된 다운스트림 신틸레이터 카메라로 샘플에서 X선 빔의 위치를 보고, 샘플의 데이터를 캡처하기 위해 래스터 스캔의 적절한 폭과 높이를 결정한다.
  7. 파장 분산 실리콘 드리프트 검출기를 90°에서 사고 빔까지, 시료에서 약 3mm 이하의 파장 분산 실리콘 드리프트 검출기를 사용하여 1-2초의 거주 시간으로 테스트 스펙트럼을 수집합니다.
  8. 테스트 스펙트럼을 보고, 스캔에 적합한 거주 시간을 선택하고 관심 요소에 충분한 신호-투-노이즈를 제공합니다.
  9. 샘플의 빔 의 현물 크기보다 현저히 작지 않거나 샘플에 대한 관심 기능보다 크지 않은 스캔에 적합한 해상도를 선택합니다.
  10. 스캔을 스캔 소프트웨어에 프로그래밍하고 이미지를 수집합니다.

X선 형광 또는 XRF, 분광법은 실온에서 시료의 원소 분석을 수행하는 데 사용되는 비파괴적인 분석 기술입니다.

XRF는 생물학적, 법의학, 환경, 심지어 예술 작품을 포함한 광범위한 샘플에 적용할 수 있습니다. 시료는 분말, 결정 및 액체와 같은 다양한 형태를 취할 수도 있습니다. XRF에서, 견본은 형광 방사선에게 불린 더 낮은 에너지에서 이차 엑스레이를 방출하는 원인이 되는 엑스레이의 광선으로 포격됩니다.

형광 기술로 불리지만, XRF는 낮은 에너지 가시광선 또는 빛 활성 분자를 사용하지 않는다는 점에서 기존의 형광 현미경 검사법과 다릅니다.

이 비디오는 XRF의 기초를 소개하고 생물학적 샘플의 원소 맵을 수집하는 방법을 보여줍니다.

충분한 에너지의 광자가 원자와 충돌하면 에너지가 흡수되어 외부 쉘 전자 중 하나가 흥미진진합니다. 전자가 이완되면 일반적으로 낮은 에너지의 보조 광자입니다. 이 과정은 형광이라고합니다. 형광 현미경 검사법에 사용되는 것과 같이 저에너지 광자는 내부 껍질에서 단단히 고정 된 전자를 완전히 추방 할 만큼 에너지가 넘칩니다. 고에너지 쉘의 전자는 공석에 빠지게 됩니다. 두 포탄 간의 에너지 차이에 비례하는 광자가 방출됩니다. 각 요소는 요소를 식별하고 존재하는 수량을 결정하는 데 사용할 수 있는 고유한 광자 또는 스펙트럼 집합을 방출합니다. 이 현상은 엑스레이 형광으로 알려져 있습니다.

원소 스펙트럼이 수집되면 관심 요소의 신호를 격리할 수 있습니다. 샘플의 여러 위치에서 측정을 수행하여 한 번에 1픽셀의 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 프로세스를 래스터 스캐닝이라고 합니다. 관심있는 모든 요소의 이미지는 이후에 생성 될 수 있습니다. 이러한 원소 맵은 샘플에 대한 중요한 정보를 제공합니다. XRF의 이해를 통해 원소 맵을 생성하기 위해 생물학적 세포 샘플을 준비할 준비가 되었습니다.

먼저 실리콘 질화물 창을 준비하고 살균하여 스캔을 위해 샘플을 제자리에 고정시합니다. 그들은 매우 깨지기 쉬운 으로, 관리를 사용합니다. 창이 평평해지 않도록 방향을 지정합니다. 그런 다음 창문을 문화 접시에 넣고 작은 접착제 테이프를 사용하여 접시에 부착하십시오.

마지막으로, 1 시간 동안 UV 방사선으로 실리콘 nitride 창을 살균하십시오.

창이 멸균되었으므로 샘플을 수정할 수 있습니다. 먼저 문화 요리를 비스듬히 잡고 접시 측면에 미디어를 추가합니다. 천천히 창을 코팅하는 기울기를 완화. 같은 방식으로 접시에 세포를 추가하고 배양합니다.

그들은 사용할 준비가 될 때까지 주기적으로 가벼운 현미경으로 세포를 관찰.

라미나르 플로우 후드에 부드럽게 접시에서 미디어를 흡인.

그런 다음, 과도한 매체를 제거하기 위해 인산염 완충식식염으로 세포를 헹구는다.

PBS를 흡인하고, 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다. 20 분 후, 혼합물을 제거하고 유해 폐기물로 폐기하십시오.

접시에서 창을 제거하고 김스 와이프로 창의 가장자리와 다시 들여 쓰기를 빠르게 얼룩지게합니다. 깨끗한 표면에 창을 설정하여 건조시다.

샘플이 건조되면 가벼운 현미경으로 창에 세포의 존재를 확인합니다.

투명 매니큐어를 사용하여 창을 알루미늄 홀더에 고정하십시오.

샘플 홀더를 계측기 마운트에 삽입한 다음 X선 현미경의 포지셔닝 단계에 마운트를 배치합니다.

시료 창을 X선 현미경 광학의 초점에 배치하고, 사고 빔에 45도 각도를 갖는다.

계측기 영역을 종료하고 X선 노출을 최소화하기 위해 원격으로 나머지 단계를 수행합니다.

셔터를 열고 광학 장치를 사용하여 단색 X 선 빔을 마이크로미터 산지 크기로 집중시합니다.

스팟의 위치는 미리 보정된 카메라로 이미지화할 수 있습니다. 위치 지정 단계를 사용하여 샘플 위에 래스터하는 데 필요한 적절한 너비와 높이를 결정합니다.

1 - 2 초의 거주 시간으로 관심 요소의 테스트 스펙트럼을 수집합니다.

테스트 스펙트럼에서 관심 요소에 충분한 신호 대 잡음 비율을 제공하기 위해 적절한 스캔 시간을 선택합니다.

그런 다음 샘플에 필요한 해상도를 결정합니다. 해상도는 관심 있는 기능보다 작아야 하지만 스팟 크기보다 큽습니다. 마지막으로 스캔을 스캔 소프트웨어에 프로그래밍하고 이미지를 수집합니다.

이 실험에서는 셀의 원소 맵이 여러 가지 요소에 대해 수행되었습니다. 구리, 철 및 아연과 같은 많은 금속은 세포에서 중요한 영양소이며 세포 내에서 명확하게 확인되었습니다.

각 금속이 세포에서 발견되는 위치를 결정함으로써, 귀중한 정보는 정상적인 세포 과정에 대해 해명 될 수있다. 또한 금속 계 질환도 이해할 수 있다.

X선 형광은 광범위한 과학 분야에서 사용됩니다. XRF의 비파괴적 특성은 역사적 유물의 연구에 사용할 수 있습니다. 미술 사학자들은 이 기술을 활용하여 원래 예술 작품에 사용된 안료를 결정합니다. 이것은 출처, 시간이 지남에 따라 퇴색 한 색상 및 진위와 같은 작업에 대한 정보를 설명 할 수 있습니다. 법의학 과학자들은 또한 범죄 현장 조사에서 XRF를 사용합니다. 총이 발사되면 주변 지역은 총탄 잔류물로 코팅됩니다. 총 사격 잔류물은 총 분말, 점화 프라이머, 케이스와 총알의 금속을 포함합니다. XRF로 수집된 정보는 사용된 범인과 무기를 식별할 수 있습니다.

X 선 형광에 자신을 빌려 연구의 또 다른 분야는 고생물학이다. 여기서 원소 정보는 2억 5천만 년 전에 살았던 해양 절지동물인 삼엽물 화석에서 수집됩니다.

화석의 원소 구성을 특성화함으로써, 새로운 정보는 긴 멸종 수명에 대해 얻을 수있다. 더 잘 보존된 샘플은 오래 전에 악화된 연조직의 구성을 제공할 수도 있습니다.

당신은 X 선 형광에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이제 X 선 분광기 이론과 광범위한 소스에서 원소 정보를 수집하는 방법을 이해해야 합니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

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Results

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부착 셀의 X선 형광 맵은 도 1에도시된다. 각 패널은 셀 위에 특정 요소(예: 구리, 철, 아연 등)의 분포를 나타낸다. 's_a'라고 표시된 패널은 엑스레이의 흡수를 보여줍니다.

Figure 1
그림 1. 부착 셀의 X 선 형광지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Applications and Summary

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엑스레이 형광 화상 진찰은 지구과학, 법의학, 재료 과학, 생물학, 심지어 우리의 문화유산을 공부하는 것을 포함하여 많은 분야에서 유용한 공구가 될 수 있습니다. 재료 과학에서 금속으로 만든 칩과 촉매의 결함을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 문화유산 작업에서, 그것은 유명한 죽은 사람들의 머리에 유독 한 금속을 식별하는 데 사용되었습니다 (예 : 베토벤), 예술에 사용되는 페인트의 소스를 식별하는 데 사용되었습니다. 생물학에서는 중요한 생화학을 수행하는 천연 금속을 연구하는 데 사용됩니다. 지질 과학에서, 그것은 종종 바위 기록에 기록 된 이벤트를 연구 하는 데 사용 됩니다. X선 형광 이미징을 너무 많은 분야에서 유용하게 만드는 두 가지 특성은 1) 비파괴적, 희귀하거나 높은 값의 많은 항목을 이미지할 수 있으며, 2) 세포에 대해 설명된 샘플 준비는 복잡합니다- 세포는 바위, 예술 또는 기타 품목과 같은 많은 재료에 대해 건조되어야 하기 때문입니다. , 평평하고 먼지가 없어야하는 것 이외에 는 샘플 준비가 거의 필요하지 않습니다. 이러한 시설에서 과학자들과의 협력을 통해 가장 잘 접근할 수 있는 싱크로트론이 필요하지만, 이 기술은 매우 접근할 수 있습니다.

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