Overview
מקור: המעבדה של ד"ר יורי בולשאן — המכון הטכנולוגי של אוניברסיטת אונטריו
כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) היא שיטה כרומטוגרפית המשמשת להפרדת תערובות של תרכובות לא נדיפות. צלחת TLC מורכבת משכבה דקה של חומר ספיח (השלב הנייח) הקבוע לתמיכה מוצקה מתאימה כגון פלסטיק, אלומיניום או זכוכית1. הדגימות ותרכובות הייחוס מומסות בממס מתאים ומוחלות ליד הקצה התחתון של צלחת TLC בנקודות קטנות. צלחת TLC מפותחת על ידי טבילת הקצה התחתון בממס המתפתח המורכב משלב נייד מתאים. פעולה נימית מאפשרת לשלב הנייד להתקדם בשכבה הסוררת. כאשר הממס נע במעלה צלחת TLC, הוא נושא איתו את הרכיבים של כל נקודה ומפריד ביניהם בהתבסס על האינטראקציות הפיזיות שלהם עם השלבים הניידים והנייחים.
Principles
כרומטוגרפיה כרוכה בהפרדה של תערובת של תרכובות על ידי הפצת הרכיבים בין שני שלבים2. השלב הנייח קבוע במקום בעוד השלב הנייד מותר לזרום דרך השלב הנייח, נושא את מרכיבי התערובת עם זה. המאפיינים של תרכובות כגון מסיסות בשלב הנייד ואת כוח האינטראקציה עם השלב הנייח להשפיע על קצב שבו הם נישאים דרך המדיום. מאז סוגים שונים של תרכובות יש תכונות פיזיות שונות, הם נישאים בשיעורים שונים המאפשרים הפרדה של מרכיבי התערובת.
וידאו זה ידגים את ההפרדה וההדמיה של תערובות של תרכובות באמצעות הטכניקה של כרומטוגרפיה שכבה דקה חד ממדית (TLC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. לוחות TLC
- ספיחות נפוצות עבור TLC הם ג'ל סיליקה, אלומינה ותאית. לוחות TLC זמינים מסחרית עם מגוון רחב של מקומות אירוח. בחר צלחת TLC וחתוך אותו לגודל מתאים (כ 5 ס"מ x 5 ס"מ מספיק עבור רוב היישומים). עבור לוחות TLC מגובים זכוכית, להבקיע את הכוס באמצעות סרגל וחותך זכוכית, ולאחר מכן בזהירות לשבור לאורך הקו.
2. תצפית
- ממיסים את המדגם בממס מתאים כדי ליצור פתרון של כ-1%. במידת האפשר הממס צריך להיות לא קוטבי. שברי כרומטוגרפיה עמודה ופתרונות דילול אחרים עשויים לשמש ללא דילול אם solute קיים בריכוז בין 0.2% ל 2.0%.
- סמן את קו הבסיס עם עיפרון כ -1.0 ס"מ מתחתית הצלחת. מקם את הנקודות לפחות 1.0 ס"מ מקצה הצלחת ולתייג אותם כראוי.
- כתמים עשויים להיות מיושמים באמצעות נימי זכוכית. כדי לזהות את צלחת TLC, לטבול את נימי לתוך הפתרון לצייר כמות קטנה של נוזל. געו בעדינות בקצה למיקום הרצוי בצלחת TLC והסירו אותו מיד.
- לחלופין, להחיל כתמים עם מזרק microliter על ידי מתן כ 1 μL של פתרון עבור כל יישום.
- כתמים עשויים להיות מיושמים ברציפות בכל מיקום, תוך הקפדה לא להפריע את פני השטח של ספיחה עם הצופה. אפשר לממס להתייבש בין יישומים.
3. בחירת ממס מתפתח
- עדיף להשתמש בממס הקוטבי הכי פחות אפשרי להפרדה טובה. ממיסים נפוצים עבור TLC כוללים הקסאן, אתיל אצטט, דיכלורומתאן ומתנול (טבלה 1).
- דרך נוחה למצוא שלב נייד מתאים היא לזהות את צלחת TLC עם מדגם. החל מספיק ממס ישירות על המקום כדי ליצור מעגל של ממס בקוטר 1-2 ס"מ. סמן את היקף המעגל. עם ההדמיה ממס מתאים יציג טבעות מופרדות היטב, עם הטבעת החיצונית ביותר על 50% המרחק מהמרכז לחזית הממס.
- ייתכן שיהיה צורך להתאים את הקוטביות של השלב הנייד על ידי בחירת שני ממיסים שונים ובדיקתם בפרופורציות שונות. דוגמאות לתערובות נפוצות הן hexanes עם אתיל אצטט ו dichloromethane עם מתנול.
4. פיתוח
- מניחים את צלחת TLC המנוקדת בתא מתפתח המכיל את הממס המתפתח המתאים. קו הממס צריך להיות מתחת לקו הבסיס המסומן בלוח TLC.
- התא המתפתח יכול להיות צנצנת עם מכסה, או מכוסה רדיד אלומיניום או סרט פלסטיק. השתמש במיכל הקטן ביותר הזמין שיתאים ללוח TLC.
- אל תאפשר לממס להגיע לקצה העליון של הצלחת. כאשר חזית הממס (הגבול שבו החלק הרטוב של הסופחה מסתיים) הוא 5-10 מ"מ מהצלחת העליונה, להסיר את צלחת TLC מן התא המתפתח ולסמן את חזית הממס עם עיפרון לפני הממס מתייבש.
5. ויזואליזציה
- ניתן לדמיין מיד כתמים צבעוניים ולסמן בעיפרון. לעתים קרובות, כתמים אינם גלויים ולכן חייב להיות חזותי על ידי שיטה אחרת.
- לעתים קרובות, ספיחת TLC מכילה אינדיקטור פלואורסצנטי. כתמים עשויים להיות חזותיים באמצעות מנורה אולטרה סגולה (UV) ידנית. תרכובות כי להרוות פלואורסצנטיות יופיעו כתמים כהים כאשר הצלחת מוקרן עם גל קצר (254 ננומטר) אור UV. תרכובות פלואורסצנטיות ייצרו נקודות בהירות כאשר מוקרן עם אור UV של אורך גל מתאים. סמן את מרכז כל נקודה בעיפרון.
- כתמים עשויים גם להיות חזותיים על ידי החלת ריאגנט חזותי או כתם על צלחת TLC. ריאגנט הדמיה עשוי להיות מיושם על ידי טבילת הצלחת לתוך ריאגנט, או על ידי ניגוב הצלחת עם כדור כותנה רווי ריאגנט לא קורוזיטיבי.
- פתרון 20% של חומצה phosphomolybdic באתנול הוא שימושי להדמיה של רוב התרכובות האורגניות. הכתמים מופיעים על חימום הצלחת עם אקדח חום או בתנור.
- ריאגנטים אחרים עשויים לשמש להדמיה של סוגים ספציפיים של תרכובות. לדוגמה, ריאגנט נינאהידרין משמש להדמיה של חומצות אמינו, ו-2,4-דיניטרופינילהידרזין עבור אלדהידים וקטונים.
6. ניתוח
- גורם הפיגור (Rf) הוא היחס בין המרחק שמתחם נוסע במעלה צלחת TLC למרחק שהממס נוסע. זה עשוי להיקבע על ידי מדידת המרחק מקו הבסיס למרכז הנקודה וחלוקת הערך לפי המרחק מקו הבסיס לחזית הממס.
- ה- Rf של תרכובת אופייני למאפייניו הפיזיים ותלוי בגורמים כגון טמפרטורה, גודל המדגם, ועובי ופעילות של ספיח, טמפרטורה וגודל המדגם.
- כדי לאשר כי לא ידוע זהה לתרכובת ידועה, יש להבחין בתקן על אותה צלחת TLC. חומרים זהים יהיו באותו מאפיין Rf.
כרומטוגרפיה של שכבה דקה, או TLC, היא שיטה כרומטוגרפית המשמשת להפרדת תערובות של תרכובות לא נדיפות, הנפוצות בכימיה אורגנית.
TLC מבוצע על צלחת מגובה זכוכית או פלסטיק. קו בסיס מסומן בלוח, יחד עם תוויות. התערובת הנבדקת ותרכובות הייחוס מומסות בממס מתאים ומוחלות ליד הקצה התחתון של צלחת TLC בנקודות קטנות. הצלחת ממוקמת בצנצנת, וממס (השלב הנייד) מפריד את התערובת בהתבסס על תכונות פיזיות של כל רכיב.
למרות העובדה שלטכניקות הפרדה כבדות יותר למכשירים יש יותר כוח פתרון מאשר ל- TLC, המהירות והעלות הנמוכה הם שהופכים את TLC לטכניקה אטרקטיבית לניתוח איכותי תוך כדי תנועה. וידאו זה מדגים את ההכנה, הפעולה והניתוח של כרומטוגרפיה של שכבה דקה.
טכניקות כרומטוגרפיות כוללות שלב נייח ונייד. ב- TLC, השלב הנייח מורכב משכבה דקה של חומר קבוע לצלחת. החומר הוא חומר קוטבי, כגון ג'ל סיליקה. השלב הנייד הוא נוזל שאינו קוטבי שמעלה את שכבת העגבת על ידי פעולה נימית. כאשר השלב הנייד נע במעלה הצלחת, הוא גורר לאורך הרכיבים של כל נקודה, אשר מופרדים לאחר מכן בהתבסס על קוטביות.
תרכובות כי הם פחות קוטב יבלה יותר זמן בשלב הנייד כפי שהוא משך את הצלחת. תרכובות כי הם קוטביים יותר נמשכים יותר לשלב נייח, ולכן לא לעלות את הצלחת ככל.
ההפרדה מתרחשת במיכל מתפתח. אלה יכולים להיות צנצנות עם מכסים או כוסות מכוסה רדיד אלומיניום. השתמש במיכל הקטן ביותר הזמין שיתאים ללוח TLC כדי להאיץ את ההפרדה.
השלב הנייד, או פיתוח ממס, צריך להיות לא קוטבי ככל האפשר עבור הפרדה טובה. מוצג כאן היא סדרה eluotropic עבור ג'ל סיליקה, רשימה של שלבים ניידים נפוצים על מנת להגדיל את כוח החילוץ.
ניתן לבדוק מספר שלבים ניידים בו-זמנית. על צלחת נקייה, לזהות את המדגם המומס מספר פעמים, לפחות 2 ס"מ זה מזה. יש למרוח מספיק שלב נייד על כל נקודה כדי ליצור עיגול בקוטר 1-2 ס"מ.
סמן את המרחק שהשלב הנייד עובר. אם השלב הנייד אינו קוטבי מספיק, המדגם יישאר קרוב לנקודה הראשונית. אם השלב הנייד הוא קוטבי מדי, כל המדגם יעבור עם חזית הממס. שלב נייד מתאים יציג טבעות מופרדות היטב, עם הטבעת החיצונית ביותר כ -50% מהמרחק לחזית הממס.
במידת הצורך, שני שלבים ניידים שונים יכולים להיות מעורבים בממדים שונים כדי להשיג את המאפיינים הרצויים. כאן, תערובת 1:1 של אתיל אצטט והקסאן הייתה קוטבית מדי, אבל תערובת של 1: 20 הופרדו כראוי.
עם השלב הנייד שנבחר, אתה מוכן להתחיל לפתח את הצלחת.
כדי להתחיל את ההליך, לחתוך צלחת TLC זמין מסחרית לגודל הרצוי. אם לצלחת יש גיבוי זכוכית, הבקיעו אותה עם חותך זכוכית ושברו בזהירות לאורך הקו.
בעזרת עיפרון, מסמנים קו בסיס כ-1 ס"מ מתחתית הצלחת. סמן את המיקום שבו הדגימות יזוהו לאורך הקו. ודא כתמים הם לפחות 1 ס"מ מהקצה ו 3 מ"מ זה מזה. תייג אותם כראוי.
דגימות מוצקות חייב להיות מומס בממס מתאים. ממיסים נפוצים כוללים hexanes, אצטט אתיל, או dichloromethane. השתמש בממס הקוטבי הכי פחות ימס את הדגימה.
צייר את תערובת המדגם / ממס עם נימי זכוכית. געו בעדינות בקצה למיקום הרצוי בצלחת TLC והסירו אותו מיד. חשוב לא להפריע לשלב הנייח.
שמור על המקום קטן ככל האפשר, כמו זה מוביל הפרדה טובה יותר. אם יש צורך במדגם נוסף, ניתן להחיל כתמים ברציפות בכל מיקום. אפשר לממס להתייבש בין יישומים. זרם של אוויר יכול לשמש לייבוש ממיסים פחות נדיפים.
לוחית TLC מוכנה כעת לפיתוח. מניחים פיסת נייר סינון בתחתית הצנצנת כדי להגביר את לחץ האדים. הוסף את השלב הנייד לעומק שאינו מגיע לקו הבסיס. מכסים את הצנצנת כאשר לא בשימוש כך אדי ממס לא לברוח.
מניחים בזהירות את צלחת TLC המנוקדת בצנצנת המתפתחת. ודא שהשלב הנייד נמצא מתחת לקו הבסיס. צפה בהתקדמות חזית הממס - הקצה המוביל של השלב הנייד - מכיוון שהוא יעבור במהירות במעלה הצלחת.
אל תאפשר לשלב הנייד להגיע לקצה העליון של הצלחת, כמו רצועות מדגם יתחילו להתרחב באמצעות דיפוזיה. ברגע שחזית הממס מתקרבת לפסגה, הסר את הצלחת מהתא המתפתח וסמן את חזית הממס בעיפרון לפני שהממס מתייבש.
אם התרכובות אינן צבעוניות, מנורת UV יכולה לשמש כדי לדמיין את הכתמים. המתחם יחסום את פלואורסצנטיות הרקע של הצלחת. הגדר את המנורה להגדרת הגל הקצר, ולהאיר את הצלחת היבשה. באמצעות עיפרון, יש לרמות את כל הכתמים הנראים מתחת למנורה. באמצעות עיפרון, יש לרמות את כל הכתמים הנראים מתחת למנורה.
טכניקת הדמיה אפשרית נוספת היא להשתמש באשלגן פרמנגונט, חומר מחמצן. בעזרת פינצטה, טובלים את הצלחת בכתם הקנגונט.
מוציאים ומנגבים תמיסה עודפת עם מגבת נייר. במכסה המנוע האדים, מחממים בזהירות את הצלחת עם אקדח חום כדי לדמיין את הכתמים. השתמש בעיפרון כדי לסמן כתמים שיופיעו.
לאחר הכתמים כבר לדמיין, את מהות העניין ניתן להשוות לסטנדרטים, כפי שמוצג כאן. בדוגמה זו, הלא ידוע הוא 1,3-diphenylpropynone, אבן בניין בסינתזה אורגנית. על ידי השוואת הרצועה תקן ידוע בנזואיל כלוריד, אחד החומרים ההתחלתיים, ניתן לזהות את המוצר.
גורם הפיגור, או Rf, משמש לזיהוי המתחם הלא ידוע. ה- Rf הוא היחס בין המרחק שמתחם נוסע במעלה צלחת TLC למרחק שהשלב הנייד עובר. הגורם נקבע על ידי מדידת המרחק מקו הבסיס לנקודה וחלוקה לפי המרחק מקו הבסיס לחזית הממס.
ה- Rf של תרכובת נתונה תלוי בתנאים המשמשים בניסוי, כולל בחירת ממס, עובי ופעילות של ספיח, טמפרטורה וגודל המדגם. יש להקפיד על שמירה על עקביות בין ניסויים.
ישנם מספר יישומים של כרומטוגרפיה שכבה דקה.
בדוגמה זו, התוכן triacylglyceride של בלוטות החלב עטלף נחקר. שבר משטח השומנים הופרד לראשונה על ידי קוטביות על צלחת TLC. הלהקה triacylglyceride הוסר לאחר מכן מהצלחת עם מרית. אבקת סיליקה הועברה לצינור microcentrifuge עם ממס. לאחר צנטריפוגה, השלב הנייח הושאר בתחתית הצינור, בעוד התרכובות נותרו מומסות בממס. הטריאציליצרידים הופרדו עוד יותר על ידי תכונה פיזית אחרת. במקרה זה, הממד השני של ההפרדה היה גודל מולקולרי.
TLC יכול לשמש גם כדי לפקח על ההתקדמות של תגובה כימית. בדוגמה זו, החומר ההתחלתי של התגובה שימש כסטנדרט, ורץ לצד פתרון התגובה על צלחת TLC. תהליך זה חזר על עצמו במרווחי זמן ספציפיים במהלך התגובה. ככל שהתגובה התקדמה, רצועת החומר ההתחלתי פחתה ורצועת המוצר גדלה. כאשר לא היה שינוי בלהקות, או שכל החומר ההתחלתי נצרך, התגובה הושלמה.
לבסוף, לוחות TLC ניתן להשתמש ב bioassays. בדוגמה זו, תרכובות הופרדו תלתן אדום עם TLC. כל להקה הונחה אז על חיידקים הגדלים על לוחות אגר. מולקולות שהראו צמיחה חיידקית מעוכבת נותחו עוד יותר עבור תכונותיהם האנטי מיקרוביאליות.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לכרומטוגרפיה של שכבה דקה. עכשיו אתה צריך להבין את התיאוריה הבסיסית של ההפרדה, איך לבחור שלב נייד מתאים לניסוי שלך, וכיצד להגדיר ולהפעיל צלחת TLC. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
דוגמה ללוח TLC טיפוסי מוצגת באיור 1. תרכובת לא ידועה 'A' ניתן להשוות לתקנים ידועים 'B' באמצעות 'E'. קביעת ערך Rf עבור כל רכיב מושגת על-ידי איתור כל תרכובת בהתאמה, פיתוח לוח TLC והדמיה חזותית. ה- Rf של תרכובת לא ידועה 'A' מחושב על-ידי מדידת גובה הספוט (y) וחלוקה לפי גובה הממס (z). השוואת ערך זה ל- Rf שנקבע עבור כל אחד מהתקנים מאפשרת זיהוי של המתחם הלא ידוע.
איור 1. שרטוט של לוחית TLC. גורם הפיגור (Rf) צריך להיות עקבי בין ניסויים כל עוד התנאים מתקיימים קבועים.
טבלה 1. סדרת אלוטרופית עבור סיליקה ג'ל. רשימה של שלבים ניידים נפוצים על מנת להגדיל את כוח ההגברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
TLC יש מספר יישומים מעשיים במעבדה. TLC עשוי לשמש לזיהוי תרכובות לא ידועות ורכיבים לא ידועים של תערובות בהשוואה לתקנים. TLC משמש בדרך כלל כדי לפקח על מהלך של תגובה כימית, ולהעריך את טוהר המוצר באמצעות השוואה של כמויות יחסיות של מגיבים, מוצרים, ותוצרי לוואי על כרומטוגרמה רצופה לאורך זמן. TLC יכול לשמש גם כדי לקבוע אם חומר מטוהר על ידי שיטות אחרות (כגון recrystallization או זיקוק) עדיין מכיל כמות משמעותית של טומאות.
כאשר תרכובות דומות לא ניתן לפתור עם TLC, הם יכולים להיות מופרדים עוד יותר בהתבסס על מאפיין פיזי אחר, המכונה הפרדה דו ממדית. בדוגמה אחת, TLC שימש להפרדת שיעורי שומנים רחבים (טריגליצרידים, סטרולים, חומצות שומן וכו ') המופרש על ידי בלוטות החלב של היונקים. הכיתות השונות הופרדו עוד יותר על ידי ספקטרומטריית מסה3.
במיקרוביולוגיה, TLC משמש הקרנות ביואוטוגרפיה עבור תרכובות מיקרוביאלית צמחית חדשנית4. לאחר תרכובות הופרדו מתמצית של הצמח המדובר, הרצועות ניתן להחיל ישירות על תרביות מיקרוביאלית. להקות שנצפו כדי לעכב את הצמיחה נחקרים עוד יותר כמועמדים סבירים.
TLC היא שיטה פשוטה לקביעת שלב נייד מתאים להפרדה של תערובת על ידי כרומטוגרפיה עמודה. בנוסף, הוא משמש כדי לקבוע את הרכב של השברים השונים שנאספו במהלך הפרדת כרומטוגרפיה עמודה, כך שברים המכילים את המתחם הרצוי ניתן לזהות ולאסוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
References
- Lehman, J. W. The student's lab companion: laboratory techniques for organic chemistry: standard scale and microscale. Pearson College Div, (2008).
- Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G. S., & Engel, R. G. Microscale and Macroscale Techniques. Thomson Wadsworth, (2006).
- Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, (2013).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (85), e51411, (2014).
