Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

L'obiettivo generale di questo studio è purificare in modo standardizzato le vescicole della membrana esterna, o OMV, da Legionella pneumophila e analizzarne l'influenza sulla replicazione batterica nei macrofagi umani e murini. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulle vescicole della membrana esterna. Ad esempio, la procedura standardizzata per la preparazione delle OMV può aiutare a studiarne l'impatto sull'interazione ospite-patogeno.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornirà un protocollo standardizzato per studiare l'impatto delle OMV di Legionella pneumophila sui macrofagi umani o murini, migliorando così la nostra comprensione della patogenicità di Legionella pneumophila. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo considerato il possibile potenziale pro-infiammatorio delle OMV e il modo in cui questo potrebbe influenzare l'andamento dell'infezione, dato che le OMV vengono rilasciate da Legionella sia all'interno della cellula ospite che in forma extracellulare. La procedura sarà dimostrata da Kerstin Hoffmann, tecnica del mio laboratorio, e da Analina Young, ricercatrice post dottorato.

Per iniziare, in condizioni sterili, distribuire il ceppo core B di L.pneumophila su piastre di agar BCYE e incubare a 37 gradi Celsius per tre giorni. Utilizzare il ceppo di L.pneumophila proveniente da una piastra di precoltura per inoculare 10 millilitri di terreno YEB a un OD600 di 0.3 e incubare i batteri a 37 gradi Celsius su un agitatore rotante per sei ore. Verificare la purezza della coltura liquida distribuendo 100 microlitri della sospensione su una piastra di agar sangue.

Incubare la piastra di agar sangue durante la notte a 37 gradi Celsius. Aggiungere la coltura liquida rimanente a 90 millilitri di mezzo YEB fresco e incubare la coltura in agitazione rotante fino a quando non raggiunge un OD600 compreso tra 3,0 e 3,5. Centrifugare la coltura liquida a 4.000 ×g per 20 minuti per ottenere il pellet batterico.

Quindi trasferire il soprannatante in nuove provette da centrifuga. Scartare i pellet batterici e centrifugare nuovamente i campioni prima di ripetere il passaggio di centrifugazione un’altra volta. Successivamente, filtrare e sterilizzare due volte il soprannatante rimanente.

Trasferire quindi il surnatante privo di batteri in provette per ultracentrifuga e centrifugare i campioni a 100.000 g a quattro gradi Celsius per tre ore. Decantare il surnatante e scartarlo. Successivamente, utilizzare PBS sterile per risospendere i pellet di OMV e raccoglierli in un unico campione.

Ripetere il passaggio di ultracentrifugazione per rimuovere le proteine contaminanti e il LPS libero. A questo punto, scartare il soprannatante e asciugare il tubo dell'ultracentrifuga con un bastoncino di cotone sterile. Risospendere il pellet di OMV con 500 microlitri di PBS sterile.

Successivamente, effettuare un’incocciatura di 20 microlitri ciascuno su piastre di agar sangue e agar BCYE per escludere la contaminazione batterica delle vescicole preparate. Incubare la piastra di agar sangue per tutta la notte e la piastra di agar BCYE per tre giorni. Utilizzare il saggio BCYE seguendo le istruzioni del produttore per quantificare la quantità di proteina presente nella preparazione ottenuta di OMV.

Dopo aver differenziato le cellule THP-1 in macrofagi seguendo il protocollo descritto nel testo, utilizzare 500 microlitri di mezzo fresco per sostituire il mezzo di differenziazione e incubare le cellule per ulteriori 24 ore a 37 gradi Celsius. Per trattare le cellule THP-1 o i macrofagi derivati da midollo osseo murino (BMDM) con OMV, scongelare le OMV precedentemente preparate e aggiungere la quantità appropriata alle cellule. Incubare i macrofagi con le OMV a 37 gradi Celsius per almeno 20 ore per infettare cellule THP-1 pretrattate o non trattate con il ceppo wild-type L.pneumophila core B o cellule BMDM murine con un mutante privo di flagelli di questo ceppo, senza cambiare il mezzo delle cellule.

Aggiungere i batteri a un MOI di 0,5, pari a una volta 10 alla quinta L. pneumophila per pozzetto. Incubare le colture rispettivamente per 24 e 48 ore. Per lisare le cellule, aggiungere saponina a una concentrazione finale dello 0,1% e incubare le cellule per cinque minuti.

Quindi risospendere i macrofagi lisati mediante pipettaggio e trasferire la sospensione in un recipiente di reazione. Utilizzare PBS sterile per preparare diluizioni seriali della sospensione di L.pneumophila. Successivamente, seminare 50 microlitri delle diluizioni richieste su piastre di agar BCYE e incubare le piastre per tre giorni.

Contare visivamente le colonie formate ad occhio nudo ed eseguire i calcoli secondo il protocollo indicato nel testo. In questo esperimento, volto a esaminare il potenziale pro-infiammatorio delle OMV di L.pneumophila, le cellule THP-1 differenziate con PMA rispondono con un aumento dipendente dal tempo e dalla dose nella secrezione di IL-8 e IL-6. Qui, l'influenza di diversi recettori toll-simili sul riconoscimento delle OMV di L.pneumophila è stata analizzata in BMDM murini con diversi background genetici, utilizzando un saggio ELISA per CXCL-1.

I BMDM murini di topi di tipo selvaggio hanno secreto CXCL-1 dopo la stimolazione con OMV, mentre i BMDM murini di topi knockout doppio per TLR2/4 ne hanno secreto significativamente meno. Per studiare l'impatto delle OMV di L.pneumophila sulla replicazione batterica nei macrofagi THP-1, le cellule sono state pre-incubate con OMV per 20 ore e successivamente infettate con L.pneumophila. La pre-stimolazione dei macrofagi derivati da THP-1 riduce inizialmente la replicazione batterica in modo dose-dipendente dopo 24 ore di infezione, mentre conduce a un raddoppio del numero di UFC in un momento successivo.

Come mostrato in questo esperimento, la pre-stimolazione dei BMDM murini con OMV determina un aumento di dieci volte del conteggio delle UFC nei BMDM murini provenienti da animali wild-type, mentre i macrofagi privi di TLR2 o privi di TRIF/MyD88 non mostrano tale aumento nella replicazione di L.pneumophila dopo la pre-incubazione con OMV. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di lavorare in condizioni sterili e di verificare la contaminazione batterica delle OMV purificate. In caso contrario, l'analisi successiva non fornisce risultati conclusivi.

Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio quale mutante di Legionella produce un numero maggiore o minore di OMV, oppure per studiare l'impatto di diverse condizioni di stress sulla secrezione di OMV. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio delle OMV per esplorare l'impatto delle OMV sulle interazioni tra patogeno e ospite in vitro e successivamente in vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come purificare le OMV e di come iniziare ad analizzarne l'effetto sull'infezione successiva dei macrofagi.

Questo protocollo può quindi essere applicato a diversi batteri Gram-negativi e alle rispettive cellule ospiti, adattando i tempi di incubazione e di crescita. Non dimenticare che il lavoro con Legionella pneumophila può essere estremamente infettivo per l'uomo, pertanto tutte le operazioni devono essere sempre eseguite sotto una cappa sterile durante la manipolazione di Legionella e l'esecuzione di questa procedura.