Non invasivo In Vivo Fluorescenza ottica di imaging dell'attività MMP infiammatoria utilizzando un agente fluorescente di imaging attivo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare l'imaging ottico per visualizzare una sonda attivabile per valutare l'attività in vivo delle metalloproteasi della matrice chiave, o MMP, in modelli sperimentali di infiammazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul meccanismo biologico sottostante nelle malattie infiammatorie. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è veloce, economica e facile da imparare.

Inoltre, è disponibile una grande varietà di sonde per il targeting di diversi processi biologici. Per l'induzione dell'artrite reumatoide, utilizzare prima un micrometro per misurare tutti i diametri delle caviglie di ciascun animale. Successivamente, sollevare delicatamente il primo topo per la coda e iniettare intraperitonealmente 200 microlitri di siero di topo KBN diluito contenente anticorpi contro la glucosio sei fosfato isomerasi o GPI.

Quindi rimetti l'animale nella sua gabbia e misura il gonfiore della caviglia ogni giorno fino al sesto giorno. Per la sensibilizzazione all'ipersensibilità da contatto, utilizzare un tagliapeli di piccoli animali per radere accuratamente un'area di due centimetri per due dell'addome di un topo anestetizzato e utilizzare una pipetta da 100 microlitri per applicare 80 microlitri di soluzione di TNCB al 5% appena preparata sulla pelle esposta. È molto importante evitare di ferire la pelle in qualsiasi momento durante la procedura, poiché ciò può portare a segnali fluorescenti non specifici all'interno dell'animale e può influire sui risultati dello studio.

Riposizionare delicatamente l'animale nella sua gabbia, evitando basse temperature corporee durante la fase di recupero. Sei giorni dopo, utilizzare una pipetta per applicare 20 microlitri di soluzione di TNCB all'1% su entrambi i lati dell'orecchio destro, seguiti dall'applicazione di 100 microlitri di TNCB all'1% ogni due giorni per un massimo di 10 giorni e dalla misurazione giornaliera dello spessore dell'orecchio. Per misurare l'attività MMP in vivo, prima agitare delicatamente il colorante per imaging ottico attivabile e caricare una siringa da insulina da 0,5 millilitri con due nanomolari del colorante per topo.

Quindi equipaggiare un'altra siringa con un ago calibro 30 attaccato a un catetere in polietilene e posizionare la coda del primo topo in acqua tiepida. Quando le vene si sono dilatate, inserire il catetere con il bordo tagliato dell'ago con un angolo di 20 gradi sul lato distale della coda in una vena caudale dilatata e risospendere la siringa per testare il corretto posizionamento del catetere. Se il catetere è posizionato in modo appropriato, sostituire la siringa e iniettare due nanomolari della sonda.

Quindi sostituire la siringa della sonda per imaging ottico con una siringa contenente una soluzione salina allo 0,9% e iniettare 25 microlitri di soluzione salina nella vena caudale per eliminare completamente il volume morto del tubo di polietilene. Quindi, imposta la scatola dello scanner di imaging ottico su 37 gradi Celsius e posiziona fino a cinque mouse nella scatola dello scanner al centro del campo visivo. 24 ore dopo l'iniezione, aprire il software di imaging e inizializzare il sistema, lasciando che la telecamera CCD si raffreddi alla temperatura di lavoro.

Quando il sistema è pronto, impostare le lunghezze d'onda e i parametri di imaging appropriati in base alla fioritura della sonda di imaging. Verrà visualizzato il pannello di controllo dell'acquisizione del sistema di imaging in vivo. Quindi fare clic su acquisisci sequenza per avviare la misurazione.

Per salvare le immagini acquisite, selezionare la posizione di salvataggio desiderata. Inoltre, è possibile aggiungere ulteriori informazioni nella finestra di modifica delle etichette delle immagini. Qui il nostro segnale fluorescente chiaramente potenziato può essere osservato nelle zampe anteriori e nelle caviglie dei topi con artrite reumatoide il sesto giorno dopo l'induzione della malattia, rispetto al segnale minimo osservato negli animali di controllo.

L'analisi della biodistribuzione dell'attività MMP negli organi degli animali da esperimento e di controllo dimostra un segnale fortemente potenziato nelle caviglie e nelle zampe anteriori, esclusivamente nelle articolazioni dei topi con artrite reumatoide. È interessante notare che un segnale MMP potenziato è stato osservato anche in entrambi i reni dei topi con artrite reumatoide, mentre il fegato e l'intestino dimostrano un robusto segnale MMP indipendentemente dal loro stato di artrite reumatoide. Durante una reazione cronica di ipersensibilità da contatto indotta da cinque TNCB all'orecchio destro, si manifesta un'attività MMP molto aumentata nell'orecchio destro infiammato rispetto all'orecchio di controllo sinistro sano.

L'analisi semiquantitativa dell'intensità del segnale delle caviglie o delle zampe artritiche e sane dimostra un'intensità del segnale MMP sette volte superiore nelle caviglie artritiche con un'intensità del segnale MMP tre volte superiore rilevata nelle zampe anteriori rispetto a quella degli animali sani. Le orecchie da reazione di ipersensibilità da contatto acute e croniche mostrano anche un segnale MMP significativamente aumentato anche dopo una sola provocazione che rimane elevato fino alla quinta provocazione. Questo metodo può essere facilmente implementato in diversi modelli animali sperimentali e consente un follow-up a lungo termine dei processi biologici e delle terapie sottostanti in vivo.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ogni sonda di imaging ottico ha una procedura di iniezione e un tempo di assorbimento diversi. Pertanto, dovrebbero essere completati studi longitudinali per ogni nuovo colorante fluorescente e sonda di imaging ottico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un massimo di cinque animali in meno di 10 minuti se eseguita correttamente.

Questo metodo è in grado di fornire informazioni sui meccanismi in vivo dell'infiammazione, ma può essere applicato anche per studiare altre malattie come il cancro o la neurodegenerazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'imaging ottico in vivo con una sonda di imaging attivabile in modelli di malattie infiammatorie.