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Overview

Para dissecar processos genéticos ou criar organismos com novas suítes de traços, os cientistas podem realizar cruzes genéticas, ou o acasalamento proposital de dois organismos. A recombinação do material genético parental na prole permite que os pesquisadores deduzam as funções, interações e localizações dos genes.

Este vídeo examinará como as cruzes genéticas foram influentes no desenvolvimento das três leis de herança de Mendel, que formam a base de nossa compreensão da genética. Uma técnica de travessia genética que foi desenvolvida pela primeira vez para organismos unicelulares, como a levedura, conhecida como análise de tetrad, será então apresentada em detalhes, seguida de alguns exemplos de como essa ferramenta clássica é usada em estudos genéticos hoje em dia.

Procedure

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Uma cruz genética é o acasalamento proposital de dois indivíduos resultando na combinação de material genético na prole. Cruzes podem ser realizadas em muitos sistemas de modelos — incluindo plantas, leveduras, moscas e camundongos — e podem ser usadas para dissecar processos genéticos ou criar organismos com novos traços.

Este vídeo abordará alguns dos princípios das cruzes genéticas, examinará um método para realizar cruzes conhecidas como análise de tetrad, e discutirá várias aplicações dessa técnica.

Primeiro, vamos introduzir os princípios básicos da herança que tornam as cruzes genéticas possíveis.

O fenótipo de um organismo, ou composição de traços, é influenciado por sua composição genética ou genótipo. Na maioria dos organismos sexualmente reproduztivos, a geração parental produz células de gameta haploides, que têm uma cópia de cada cromossomo distinto. Estes então se fundem durante o acasalamento para produzir uma prole diploide com duas cópias homólogos de cada cromossomo. Se ambos os cromossomos contêm o mesmo alelo, ou forma variante de um gene, então o organismo é "homozigo" nesse lócus genético; caso contrário, é "heterozigoso".

Para começar o ciclo de novo, o organismo diploide novamente gera gametas haploides via meiose. Durante esse processo, os dois cromossomos homólogos passam por "recombinação", onde pedaços de sequências equivalentes são trocados entre os pares. Esse processo embaralha os alelos parentais herdados por cada descendente, aumentando assim sua diversidade genética.

Uma das primeiras pessoas a realizar cruzes genéticas sistemáticas foi o "pai da genética", Gregor Mendel. Usando a planta de ervilha facilmente manipulada, e examinando uma série de traços com padrões consistentes de herança, Mendel foi capaz de derivar três leis básicas de herança que formariam a base da genética.

A primeira lei de Mendel é a Lei da Uniformidade, que estabelece que a prole heterozigoto da primeira, ou F1, geração de dois indivíduos homozigos terá o fenótipo de apenas um dos pais. O alelo que estabelece esse fenótipo é chamado de "dominante", enquanto o alelo "escondido" é "recessivo". Sabemos agora que as relações de dominação são muitas vezes menos claras, com casos como dominância incompleta, onde heterozygotes expressam um fenótipo misturado; e codominância, onde ambos os fenótipos são exibidos.

A Lei da Segregação estabelece que um alelo é aleatoriamente atribuído a cada gamete. Observando que a prole F2 da auto-fertilização de indivíduos heterozigotos F1 exibiu uma razão fenotípica de 3:1, mas que dois dos indivíduos fenotipicamente dominantes são na verdade heterozigoas, Mendel deduziu que os dois alelos parentais têm que ser herdados separadamente. Hoje, sabemos que a segregação ocorre durante a meiose, quando os dois cromossomos homólogos do pai diploide são divididos aleatoriamente em células filhas haploides, cada um herdando um dos dois alelos.

A terceira lei de Mendel é a Lei de Sortimento Independente, que estabelece que as características individuais são herdadas independentemente. Sabemos agora que a independência absoluta só existe para traços controlados por genes em cromossomos separados no conjunto haploide, que são distribuídos independentemente às células filhas durante a meiose. Para dois genes no mesmo cromossomo, a distância entre eles é inversamente proporcional à probabilidade de que eles sejam recombinados em diferentes cromossomos homólogos, e por extensão, quão provável eles são herdados juntos na mesma prole. Portanto, analisar os quatro produtos meioticos de um organismo diploide fornece uma maneira de os cientistas mapearem a localização dos genes.

Depois de rever os princípios por trás das cruzes genéticas, vamos dar uma olhada em um protocolo para análise de tetrad.

Esta técnica é tipicamente aplicada a certas algas ou fungos de célula única, como levedura, para dissecar os quatro produtos meioticos haploides, ou esporos, que nestas espécies permanecem juntos como um "tetrad" dentro de um único corpo celular.

Para realizar a análise tetrad em levedura, as cepas desejadas são cultivadas pela primeira vez em mídia apropriada. Células de levedura de colônias individuais são permitidas a acasalar, por exemplo, espalhando cada cepa em um padrão cruzado em uma nova placa. Esta placa é então banhada em mídia seletiva para isolar apenas o produto diploide da cruz.

As células diploides selecionadas são cultivadas em mídia pobre em nutrientes para induzir a esporulação e a formação de tetrad. Asci, que são as estruturas que seguram os tetrads dos esporos, são digeridas em soluções que contêm a enzima zymolyase. Após a digestão, asci individuais são manipulados usando um microscópio de dissecação de tetrad. Eles são organizados em locais específicos em uma placa de crescimento, e interrompidos para liberar os esporos individuais. Estes podem ser colocados em um padrão semelhante à grade, onde cada esporo geraria uma colônia individual que pode ser mais analisada.

Agora que você sabe como a análise do tetrad é realizada, vamos examinar algumas das muitas aplicações ou modificações desta técnica.

A dissecção manual de tetrads é demorada, e os pesquisadores criaram alternativas de alto rendimento, como o sequenciamento habilitado para código de barras de tetrads. Neste método, a prole diploide de uma cruz de levedura foi transformada com uma biblioteca de plasmídeos, cada um dos quais contém uma sequência curta e única conhecida como "código de barras" que age como um identificador para cada descendente. Os plasmídeos também expressam GFP, permitindo que asças de levedura sejam selecionadas através de citometria de fluxo e classificadas em placas de ágar. Os asci foram lysed em massa nas placas, e os esporos foram autorizados a crescer em pequenas colônias. As colônias foram então distribuídas aleatoriamente para placas de 96 poços para genotipagem. O código de barras de sequência único permite aos pesquisadores agrupar as quatro colônias que surgiram de esporos de cada tetrad.

Cruzes genéticas também podem ser usadas para gerar células de levedura com um grande número de eliminações genéticas. No processo do monstro verde, leveduras mutantes haploides carregando diferentes exclusões genéticas marcadas por GFP são acasaladas e esporladas. Estes progêneres haploides, alguns dos quais carregam exclusões herdadas de ambos os pais, são classificados através de citometria de fluxo ativada por fluorescência, onde a intensidade de GFP foi mostrada para se correlacionar com o número de exclusões presentes em uma determinada cepa de levedura. Essas células selecionadas foram então cultivadas e re-cruzadas. A repetição deste ciclo gerou cepas de levedura contendo inúmeras supressões.

Finalmente, as cruzes genéticas foram adaptadas para uso em muitos sistemas modelo, como o parasita intracelular Plasmodium,causador da malária. Como o parasita só pode se reproduzir dentro de outras células, todas as etapas de travessia devem ser realizadas em camundongos ou mosquitos, o hospedeiro natural e vetor do parasita, respectivamente. Aqui, os camundongos foram infectados com duas cepas únicas de Plasmodium no estágio do parasita sanguíneo. Os parasitas foram então transferidos para mosquitos através da alimentação sanguínea, e uma vez dentro eles amadureceram em gametas que fertilizariam para formar zygotes diploides. Os esporozoitas maduros foram então colhidos do mosquito e usados para infectar camundongos ingênuos, onde os parasitas foram propagados para isolar a prole cruzada de interesse.

Você acabou de ver o vídeo do JoVE em cruzes genéticas. Neste vídeo, introduzimos os princípios da herança, como as cruzes genéticas em alguns organismos podem ser analisadas com dissecção tetrad, e algumas aplicações atuais. Como sempre, obrigado por assistir!

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