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Overview

Gli schermi genetici sono strumenti fondamentali per definire la funzione genica e comprendere le interazioni geniche. Gli schermi in genere comportano la mutazione dei geni e quindi la valutazione degli organismi interessati per i fenotipi di interesse. Il processo può essere "forward", dove le mutazioni vengono generate in modo casuale per identificare geni sconosciuti responsabili dei fenotipi, oppure può essere "reverse", dove geni specifici sono mirati per la mutazione per osservare quali fenotipi vengono prodotti.

Qui, JoVE esamina vari tipi di screening genetici, compresi quelli che dipendono da mutazioni di perdita di funzione o guadagno di funzione, che rispettivamente diminuiscono o aumentano l'attività dei geni. Esploriamo quindi i protocolli generali per gli schermi avanti e indietro in un organismo modello popolare, il verme nematode. Infine, evidenziamo come gli schermi vengono applicati nella ricerca di oggi, ad esempio per comprendere meglio le interazioni geniche che possono contribuire alle malattie neurodegenerative.

Procedure

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Gli screening genetici sono strumenti importanti per identificare geni e mutazioni responsabili dei fenotipi di interesse e per comprendere come funzionano i geni nei processi biologici. Gli screening vengono eseguiti in vari sistemi modello, tra cui mosche, vermi, piante e colture cellulari, e hanno portato alla scoperta di nuovi percorsi cellulari e potenziali bersagli farmacologici per le malattie umane.

Questo video fornirà una panoramica dei diversi tipi di schermi genetici, spiegherà due protocolli generali per gli schermi nei vermi nematodi e mostrerà alcuni modi in cui gli schermi vengono applicati nei laboratori oggi.

Per prima cosa, diamo un'occhiata a cosa sono gli schermi genetici e cosa possiamo imparare da loro.

Gli screening genetici si basano sulla genetica in avanti o inversa. In uno screening genetico avanzato o "classico", le mutazioni sono generate casualmente nel DNA di un organismo utilizzando radiazioni o sostanze chimiche note come mutageni. Ulteriori basi possono anche essere inserite nel DNA utilizzando, ad esempio, sequenze note come trasposoni, che possono integrarsi in diverse posizioni all'interno del genoma e interrompere la funzione dei geni in cui si inseriscono. Questi tipi di inserzioni sono spesso accoppiati con reporter fluorescenti per consentire il rilevamento diretto di organismi mutati. Quando si trova che un mutante mostra un fenotipo di interesse, il gene sconosciuto che è stato mutato può quindi essere mappato su un cromosoma e sequenziato.

L'approccio opposto allo screening è uno schermo genetico inverso, in cui i ricercatori interrompono l'espressione di molti geni candidati e quindi cercano fenotipi mutanti derivanti da queste manipolazioni.

Oltre alle mutazioni di "perdita di funzione" che interrompono l'attività di un gene, gli screening genetici possono anche essere basati su mutazioni di "guadagno di funzione", che causano l'aumento dell'espressione o della funzionalità di un gene. Ciò può essere ottenuto inserendo in modo casuale elementi regolatori genici nel genoma, che guiderebbero la sovraespressione di un gene che l'elemento inserisce a monte.

In alternativa, in un metodo chiamato "screening dell'espressione", i ricercatori fanno uso di librerie di plasmidi che contengono le sequenze di codifica proteica di vari geni e le introducono nelle cellule in cui i geni saranno altamente espressi. I fenotipi risultanti possono quindi essere utilizzati per comprendere la funzione genica.

Per scoprire ulteriori informazioni su un gene o una mutazione noto, è possibile utilizzare schermi modificatori. Uno schermo soppressore inizia con un mutante caratterizzato e identifica ulteriori mutazioni che rendono il fenotipo mutante meno grave. Una mutazione soppressore trovata nello stesso gene della mutazione originale è indicata come "intragenica", mentre una mutazione soppressore situata in un gene diverso è considerata "extragenica".

Al contrario, gli schermi enhancer identificano ulteriori mutazioni che aumentano la gravità di un fenotipo mutante. Questi possono essere utili per determinare i geni che sono ridondanti o possono interagire funzionalmente. Se la combinazione di due o più mutazioni provoca una crescita gravemente compromessa o addirittura la morte, la condizione è chiamata "malattia sintetica o letalità". Uno screening per mutazioni sintetiche malate o letali rivela geni che funzionano in percorsi biologici ridondanti, ma essenziali. Ciò è particolarmente utile, ad esempio, nell'identificazione di più prodotti genici che possono essere mirati contemporaneamente a farmaci per uccidere le cellule tumorali.

Ora che hai capito alcune strategie di screening genetico comuni, diamo un'occhiata a un protocollo generale per uno schermo in avanti in un organismo modello popolare, il verme nematode.

In questo esempio, la mutagenesi chimica sarà effettuata con etilmetanosolfonato o EMS, che funziona modificando chimicamente i nucleotidi guanina, facendoli accoppiare in modo inappropriato con la timina nei successivi cicli di replicazione del DNA. Poiché l'EMS è un mutageno e un possibile cancerogeno, dovrebbe essere maneggiato solo quando si indossa un doppio strato di guanti e il lavoro dovrebbe essere condotto in una cappa aspirante.

Per iniziare, un gran numero di vermi nell'ultimo stadio larvale viene selezionato, lavato e raccolto. L'EMS viene quindi aggiunto ai vermi e i vermi vengono incubati per diverse ore per indurre mutazioni. Dopo la mutagenesi, l'EMS deve essere rimosso dai vermi e inattivato con idrossido di sodio. I vermi vengono quindi lavati più volte nel mezzo di crescita e placcati su piastre di agar.

Successivamente, i vermi dall'aspetto sano vengono trasferiti in nuovi piatti appena seminati con batteri come fonte di cibo e autorizzati a riprodursi. La progenie di seconda generazione può essere sottoposta a screening visivo per fenotipi mutanti, come i difetti della locomotiva.

Ora, passiamo attraverso un protocollo per uno screening genetico inverso nei nematodi.

Un approccio comune per effettuare screening inversi nei vermi è quello di nutrire gli animali con una libreria di batteri che esprimono RNA a doppio filamento, uno per ceppo batterico, che abbatterà l'espressione di un gene candidato ciascuno nei vermi. Queste librerie sono spesso disponibili in commercio e possono essere sotto-coltivate per l'uso negli schermi.

Per iniziare, vengono coltivate singole colonie di batteri contenenti singoli cloni della libreria e viene indotta la produzione di RNA a doppio filamento. Le colture vengono quindi individuate su pozzetti separati di una piastra con mezzo di crescita dei nematodi e lasciate asciugare in una cappa aspirante sterile.

Successivamente, i vermi vengono placcati sui batteri e lasciati nutrire in una camera umidificata per tre o quattro giorni. I fenotipi mutanti possono essere rapidamente osservati, sia nei vermi originali posti sulle piastre di alimentazione, sia nella progenie di prima generazione.

Ora che hai visto come vengono eseguiti gli screening genetici avanti e indietro, discutiamo alcune delle loro attuali applicazioni.

Alcuni screening genetici sono utilizzati per aiutare gli scienziati a identificare le proteine che interagiscono fisicamente o funzionano nello stesso percorso molecolare. In questo esperimento, gli scienziati hanno ideato uno schermo basato sulla microscopia ad alto rendimento per scoprire nuovi recettori transmembrana che attivano una particolare molecola di segnalazione. Sovraesprimendo una varietà di geni nelle cellule renali embrionali umane contenenti la proteina di segnalazione marcata fluorescentemente, sono stati in grado di monitorare quali recettori influenzano la localizzazione subcellulare della proteina.

Un'altra applicazione dello screening genetico è la caratterizzazione delle interazioni gene-farmaco. Qui, una libreria di lieviti mutanti è stata generata utilizzando mutagenesi casuale su larga scala con inserzioni di trasposone. Ogni ceppo mutante è stato poi coltivato in presenza di un farmaco. La crescita di ciascun ceppo è stata quantificata utilizzando la PCR seguita da microarray o analisi di sequenziamento per determinare quali mutanti, rispetto ai controlli non mutanti, erano sensibili al trattamento farmacologico.

Infine, gli schermi possono essere utilizzati per comprendere i geni e le reti molecolari interrotte nella malattia umana. I ricercatori in questo esperimento hanno coltivato neuroni in presenza di virus che codificano per l'RNA per abbattere l'espressione di molti geni bersaglio diversi. L'analisi automatizzata delle cellule immunogestite è stata quindi utilizzata per rivelare geni che influenzano le proprietà fisiche dei neuroni, come la crescita dei neuriti. Questo approccio ha identificato con successo i geni coinvolti nelle malattie neurodegenerative.

Hai appena visto il video di JoVE sugli schermi genetici, una potente tecnica per scoprire i geni coinvolti nei processi biologici chiave. In questo video, abbiamo esaminato alcuni dei principali tipi di schermi genetici, protocolli generali per eseguire sia schermi avanti che indietro e discusso di come questi metodi vengono applicati nei laboratori di oggi. Grazie per l'attenzione!

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