Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

DNA 메틸화 분석

Overview

CpG dinucleotides에서 메틸화는 유전자 발현조절에 중요한 역할을 하기 위해 가설이 된 DNA의 화학적 변형이다. 특히, "CpG 제도"라고 불리는 메틸화 부위의 클러스터의 메틸화는 프로모터 및 기타 유전자 조절 요소 근처에서 유전자의 안정적인 침묵에 기여할 수 있으며, 예를 들어 게놈 각인 및 X 염색체 불활성화와 같은 후생유전학 적 과정 동안. 동시에, 비정상적인 CpG 메틸화는 암과 연관되는 것으로 나타났다.

이 비디오에서는 DNA 메틸화의 생물학적 기능 및 메커니즘이 게놈의 메틸화 부위를 식별하는 데 사용되는 다양한 기술과 함께 제시될 것입니다. 그런 다음 DNA 메틸화를 검출하는 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나인 비설피트 분석의 단계와 이 기술의 여러 응용 을 검토합니다.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA 메틸화는 다른 세포 문맥하에서 유전자 발현에 영향을 미치는 DNA의 화학적 변형이다. 많은 연구원은 비정상적인 DNA 메틸화가 암과 같은 질병과 연관되었기 때문에이 과정의 메커니즘과 기능에 관심이 있습니다.

이 비디오에서는 DNA 메틸화의 원리와 이를 감지하는 방법을 다룰 것입니다. 그런 다음 이러한 방법 중 하나, bisulfite 분석 및 이 기술의 일부 응용 프로그램에 대한 일반적인 프로토콜을 살펴보겠습니다.

먼저 DNA 메틸화가 무엇이며 어떻게 검출할 수 있는지 살펴보겠습니다.

이 생화 확성 과정 동안, 세포는 그것의 DNA에 있는 cytosine 기지에 메틸 단으로 알려져 있는 화학 태그를 추가합니다. 대부분의 메틸화된 사이토신은 동일한 DNA 가닥에 있는 구아닌 기지 옆에 생기고, 이 인접한 뉴클레오티드-그리고 그(것)들을 연결하는 인포디스터 결합-이라고 합니다 "CpGs." 대부분의 척추동물 CpG는 메틸화되어 있지만, 미완성된 CpG는 적극적으로 발현된 유전자의 발기인 근처의 CpG "섬"과 다양한 기타 규제 서열 원소에서 가까이 발생하는 경향이 있습니다.

DNA 메틸화의 변화가 유전자 조절에 기여하는 방식은 여전히 강렬한 조사의 대상이다. CpG 제도의 메틸화는 특정 유전자의 원산지 특이적 발현인 게놈 각질과 같은 후성 유전적 과정에서 볼 수 있는 안정적이고 장기적인 유전자 침묵뿐만 아니라 X 염색체 불활성화, 여성 포유류의 각 세포에 있는 두 개의 X 염색체 중 하나의 침묵에 중요한 것으로 보인다. CpG 제도의 비정상적인 메틸화로 인한 중요한 유전자의 억압은 또한 암으로 이어질 수있는 통제되지 않는 세포 성장에 기여하는 것으로 나타났습니다. 기계적으로, DNA 메틸화는 프로모터와 연결에서 전사 요인을 방지하거나, 히스톤을 수정하고 크로마틴을 전사적으로 비 허용 상태로 리모델링하는 단백질을 모집함으로써 유전자 침묵에 기여할 수 있습니다.

DNA의 메틸화 상태를 검출하기 위한 몇몇 방법이 있습니다.

하나의 기술, HELP 분석, HpaII와 MspI라는 두 개의 제한 엔토몰리스를 포함, 이는 각각 만 미백, 또는 메틸화 및 미백, CCGG 시퀀스. 이 두 효소에 의해 생성된 소화 패턴을 비교해서, DNA의 메틸화 상태를 추론할 수 있습니다.

메틸화 된 DNA 면역 침전또는 "MeDIP"라고 불리는 또 다른 방법은 메틸화 된 DNA 서열을 풍부하게하기 위해 메틸화 된 사이토신에 결합하는 항체를 사용합니다.

마지막으로, 비설피트 분석은 메틸화 된 사이토신을 우라실로 변환하는 화학 반응을 수행함으로써 DNA의 미수정 시토신과 메틸화 된 사이토신을 구별하는 데 사용됩니다. 이러한 변환에 이어, 비설피테 처리된 DNA는 PCR, 서열, 기준 게놈에 비해 실시될 수 있다. 미수정 사이토신은 기준에 존재하지만, 비황핏 분석 및 PCR에 따라 백리민으로 대체되는 시토신입니다. 양극분석에 bisulfite 처리된 DNA를 복종해서, 연구원은 또한 "메틸화 에피그램"을 만들 수 있습니다, 이는 게놈에 있는 다른 CpGs를 선형적으로 표현하고 그들 각각에 있는 메틸화의 정도를 묘사합니다. 연구원이 다른 세포 모형 사이 메틸화 패턴을 비교하고 싶은 경우에 이러한 epigrams는 특히 유용합니다.

이제 bisulfite 분석을 위한 프로토콜을 심층 살펴보겠습니다.

우선 수산화 나트륨은 게놈 DNA의 제제에 추가되어 95°C에서 배양됩니다. 이것은 DNA를 변성하고 그것의 기지를 후속 화학 반응에 접근할 수 있게 합니다. 나트륨 metabisulfite는 그 때 변성 된 DNA 혼합물로 소개되고, 2개의 화학 반응 단계가 생길 것이다. 첫 번째 단계 동안, 황산, 황산염 군은 사이토신 황포네이트를 형성하기 위해 미백된 사이토신에 첨가된다. 그런 다음 수성 절제 중에 아미노 그룹이 시토신 설포네이트에서 제거되어 우라실 설포네이트를 생성합니다.

화학 반응의 이러한 첫 번째 단계를 용이하게하기 위해 DNA 제제는 증발을 방지하고 메타비술피트 나트륨의 농도를 유지하는 데 도움이되는 미네랄 오일과 오버레인됩니다. 반응은 어둠 속에서 55°C에서 배양됩니다. 이 단계에서, 퀴놀과 같은 산화를 방지하는 제제도 혼합물에 첨가된다.

우라실 설포네이트를 함유한 변형된 DNA를 수집하고 미네랄 오일이 없는 경우, 혼합물은 원심분리되고 가장 낮은 액체 층이 회수된다. 이 해결책에 있는 DNA는 그 때 정제됩니다.

다음으로, 수산화 나트륨은 DNA 혼합물에 첨가되어 37°C에서 배양됩니다. 이것은 당신이 짐작한 바와 같이 - 우라실 설포네이트에서 황산 염료 그룹을 제거하고 우라실을 형성하고 화학 반응을 완료하는 탈황을 유도하기 위해 수행됩니다.

마지막으로, 혼합물은 아세테이트 암모늄의 첨가로 중화되고, DNA는 에탄올 강수량에 의해 수집된다. 비황피테 변환 된 DNA가 정제되면 PCR 및 시퀀싱을 받게됩니다.

이제 bisulfite 분석을 위한 기본 기술에 대해 논의되었으므로 몇 가지 실험 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

몇몇 연구원은 유전체 각각을 조사하기 위하여 bisulfite 분석을 이용합니다. 여기에서, 연구원은 유전다름을 가진 아라비도시스의 2개의 긴장을 교차했습니다, 그래서 모계와 친자 DNA가 구별될 수 있었습니다. 결과 배아 및 관련 내정자, 또는 배아를 지원하는 조직에서 메틸화 패턴을 비교한 다음 비교되었다. 이 방법을 사용하여, 과학자는 단백질 인코딩 유전자, MEA의모계 송내의 CpGs가 배아에서 메틸화되는 경향이 있지만 조직 특정 각인을 나타내는 내정자에서 메틸화되는 경향이 있음을 발견했습니다.

그밖 연구원은 환경 또는 사회적인 요인이 메틸화 패턴을 바꿀 수 있는 방법을 이해하기 위하여 이 기술을 사용하고 있습니다. 여기에서, 마우스 새끼는 스트레스를 유도하기 위하여 그들의 어머니에서 분리되었습니다, 그들의 두뇌 조직은 이후에 고립되었습니다. 비설피테 처리 된 DNA의 시퀀싱 에 이어, 과학자들은 호르몬 인코딩 유전자AVP의메틸화 패턴이 "분리된" 새끼의 특정 뇌 영역에서 변화하여 초기 삶의 경험의 장기적인 생물학적 영향에 대한 가능한 분자 메커니즘을 시사한다고 결정했습니다.

마지막으로, 많은 연구자들은 개별, 독특한 세포 사이의 메틸화 패턴의 비교를 용이하게하기 위해 bisulfite 분석을 최적화하려고합니다. 여기서, 연구원은 모든 단계가 아가로즈에 내장된 개별 마우스 난모세포에 수행되도록 bisulfite 분석 방법을 수정, 이는 DNA 손실을 방지하는 데 도움이. 이 방법을 사용하여, 연구원은 쉽게 여러 메틸화 패턴을 준 그를 찾아서 그밖 세포로 오염된 단 하나 oocyte 견본을 쉽게 확인할 수 있었습니다.

메틸화에 민감한 분석에서 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 여기에서, 우리는 DNA 메틸화가 유전자 조절에서 재생하는 역할, 연구원이 게놈에 있는 메틸화된 지구를 확인하기 위하여 이용하는 방법, bisulfite 분석을 위한 일반화된 프로토콜, 그리고 마지막으로, 이 기술의 몇몇 응용에 토론했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter