Preparazione di vescicole a membrana plasmatica da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo per potenziali terapie di sostituzione del citoplasma

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di somministrare una nuova terapia di sostituzione del citoplasma al muscolo gastrocnemio di topi utilizzando vescicole della membrana plasmatica, o PMV, derivate da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo murino o BMSC. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande riguardo al fatto che il rifornimento di cellule con citoplasma giovane proveniente da altre BMSC tramite fusione di PMV possa migliorare o addirittura invertire i fenotipi associati all'invecchiamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'incapsulamento del citosol delle BMSC da parte delle PMV può essere indotto istantaneamente mediante estrusione meccanica.

Quando si dimostra questo metodo, è fondamentale, poiché le fasi di estrusione e costruzione sono difficili da apprendere semplicemente provando, arrivare effettivamente a padroneggiarlo. Per generare le PMV, coltivare innanzitutto le cellule BMSC di topo in mezzo di coltura DMEM completo in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule hanno raggiunto una confluenza del 90%, risciacquare il pozzetto con 0,5 millilitri di PBS privo di calcio e staccare le cellule con 0,5 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25%.

Dopo tre minuti a 37 gradi Celsius, battere leggermente la piastra con il palmo della mano alcune volte per favorire la dissociazione cellulare e arrestare la digestione aggiungendo un millilitro di mezzo di coltura. Trasferire le cellule in un tubo conico da cinque millilitri per la centrifugazione e risospendere il pellet in quattro millilitri di mezzo di coltura fresco. Successivamente, dividere le cellule tra due pozzetti di una nuova piastra a sei pozzetti e reinserire la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 24 ore.

Il giorno successivo, raccogliere le cellule da un pozzetto mediante digestione con tripsina, come appena dimostrato. Risospendere il pellet in 0,5 millilitri di mezzo di coltura fresco dopo la raccolta mediante centrifugazione. Caricare le cellule in una siringa da insulina da un millilitro e collegare la siringa a un'unità filtrante.

Premere rapidamente lo stantuffo per far passare le cellule attraverso il filtro, quindi scartare il mezzo estruso. Successivamente, caricare ed erogare 0,5 millilitri di ulteriore mezzo di coltura attraverso il filtro come appena dimostrato, raccogliendo il mezzo dalla seconda estrusione. Seminare 150 microlitri del mezzo raccolto in una piastra da 35 millilitri con fondo in vetro e lasciare sedimentare le vescicole per circa 10 minuti.

Quindi, confermare la presenza di VPM mediante un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di una telecamera CCD, utilizzando un obiettivo a 20 volte. Per evidenziare l'involucro mitocondriale e il potenziale di membrana nelle VPM, colorare una coltura di BMSC al 90% confluenti con un colorante mitocondriale appropriato o con una sonda per il potenziale di membrana mitocondriale, rispettivamente, in mezzo di coltura fresco per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, risciacquare le cellule tre volte con 0,5 millilitri di PBS per ogni lavaggio ed espiantare le cellule mediante digestione con tripsina per la generazione di VPM, come appena descritto per la loro visualizzazione mediante microscopia confocale.

Per tracciare la localizzazione citoplasmatica delle proteine del PMV, diluire innanzitutto due microgrammi di DNA plasmidico superavvolto per una cassetta di espressione EGFP e sei microlitri di reagente cationico per la trasfezione in provette singole da 0,5 millilitri contenenti 50 microlitri di DMEM privo di siero. Vortexare le provette, seguito da una breve centrifugazione. Quindi aggiungere il reagente per la trasfezione goccia a goccia nella provetta contenente la soluzione di DNA diluita.

Vortexare energicamente la miscela di trasfezione del DNA per un minuto, seguito da una breve centrifugazione e da un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere a una coltura di BMSC al 30% di confluenza in una piastra a sei pozzetti due millilitri di mezzo di coltura fresco e aggiungere la miscela di DNA goccia a goccia sulle cellule. 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere i BMSC mediante digestione con tripsina e preparare le PMV come appena illustrato.

I PMV possono quindi essere analizzati mediante microscopia confocale utilizzando un obiettivo ad immersione in olio da 100 volte. Prima di iniettare i PMV, etichettare una coltura di BMSC con un colorante fluorescente per tracciamento cellulare della membrana in un millilitro di mezzo di coltura fresco a 37 gradi Celsius per 30 minuti e raccogliere le cellule mediante digestione con tripsina. Sospendere le cellule etichettate in 0,5 millilitri di mezzo di coltura fresco integrato con un microgrammo di polietileneammina e preparare i PMV come dimostrato.

Quindi concentrare le PMV mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 100 microlitri di mezzo di coltura fresco con movimenti delicati a vortice. Successivamente, caricare le cellule in una siringa da un millilitro per insulina dotata di un ago da 30 gauge e disinfettare l'esterno del muscolo gastrocnemio di un topo BALB/c anestetizzato con etanolo al 75%. Quindi iniettare lentamente l'intero volume di PMV nel muscolo e lasciare che l'animale si riprenda sotto una lampada a calore.

Dopo 12 ore, cospargere il muscolo con etanolo al 75%, aprire la pelle con le forbici ed estrarre l'intero muscolo gastrocnemio alle due estremità. Sciacquare il muscolo con PBS e posizionarlo sotto un microscopio a fluorescenza. Utilizzando l'obiettivo a 20 volte, rimuovere con una lametta affilata i frammenti di tessuto muscolare non fluorescenti e tritare i restanti frammenti fortemente fluorescenti in cubi di circa nove millimetri cubi.

Incorporare ogni cubetto in un mezzo ottimale per la temperatura di taglio. Quindi immergere i cubetti in azoto liquido per cinque minuti. Conservare i campioni di tessuto a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi.

Le PMV generate da BMSC, come dimostrato, presentano prevalentemente una dimensione nell'ordine di circa tre micrometri di diametro, osservata mediante microscopia a contrasto di fase utilizzando un obiettivo 20 volte. La trasfezione dei BMSC con una cassetta espressiva fluorescente per 48 ore illustra l'incapsulamento citoplasmatico della proteina EGFP da parte delle PMV. Inoltre, l'uso di un colorante mitocondriale fluorescente rivela che una grande frazione delle PMV contiene mitocondri.

La maggior parte di essi risulta positiva alla colorazione con un colorante per il potenziale della membrana mitocondriale, indicando la funzionalità delle mitocondri. Il trattamento con polietileneammina prima della somministrazione in vivo impedisce l'aggregazione delle PMV durante la loro concentrazione tramite centrifugazione per la rimozione dei componenti cellulari. L'etichettatura con colorante per membrane dei BMSC prima della generazione delle PMV facilita la produzione di PMV tracciabili mediante fluorescenza.

In effetti, la visualizzazione di sezioni congelate del muscolo gastrocnemio dopo la somministrazione intramuscolare di PMV marcati indica il rilascio delle PMV nel citoplasma delle cellule muscolari, probabilmente tramite endocitosi. Quando si tenta la procedura di generazione delle PMV, è importante ricordare di caricare la siringa con il numero appropriato di cellule e di premere rapidamente lo stantuffo per far passare le cellule attraverso il filtro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia con cellule staminali per esplorare il trattamento delle malattie legate all'età nei topi.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare PMV da BMSC per il rilascio di citoplasma nel muscolo gastrocnemio dei topi.