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Introdução à Espectrometria de Massa
 
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Introdução à Espectrometria de Massa

Overview

Fonte: Laboratório do Dr. Khuloud Al-Jamal - King's College London

A espectrometria de massa é uma técnica de química analítica que permite a identificação de compostos desconhecidos dentro de uma amostra, a quantificação de materiais conhecidos, a determinação da estrutura e propriedades químicas de diferentes moléculas.

Um espectrômetro de massa é composto por uma fonte de ionização, um analisador e um detector. O processo envolve a ionização de compostos químicos para gerar íons. Ao usar plasma acoplado indutivamente (ICP), amostras contendo elementos de interesse são introduzidas no plasma de argônio como gotículas de aerossol. O plasma seca o aerossol, dissocia as moléculas, e então remove um elétron dos componentes para ser detectado pelo espectrômetro de massa. Outros métodos de ionização, como a ionização eletrospray (ESI) e a ionização de desorção a laser assistida por matriz (MALDI) são utilizados para analisar amostras biológicas. Após o procedimento de ionização, os íons são separados no espectrômetro de massa de acordo com sua relação massa-carga (m/z), e a abundância relativa de cada tipo de íon é medida. Finalmente, o detector geralmente consiste em um multiplicador de elétrons onde a colisão de íons com um ânodo carregado leva a uma cascata de número crescente de elétrons, que pode ser detectado por um circuito elétrico conectado a um computador.

Neste vídeo, o procedimento de análise do ICP-MS será descrito pela detecção de 56Fe como exemplo.

Principles

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O ICP-MS combina uma fonte ICP de alta temperatura (plasma acoplado indutivamente) com um espectrômetro de massa.

As amostras precisam estar em forma iônica antes de entrar no analisador de massa para serem detectadas. O processo de digestão de amostras sólidas consiste na incubação de amostras sólidas em ácido forte e oxidante a alta temperatura e por um período prolongado de tempo, dependendo do analito metálico. A amostra é introduzida como um aerossol no plasma ICP (temperatura de 6.000-10.000 K) para ser convertida em átomos gasosos, que são ionizados.

O analisador de massa mais usado é o filtro de massa quadrupole. Funciona como um filtro eletrostático que só permite que íons de uma única relação massa-carga (m/z) cheguem ao detector em um determinado momento. Ele pode separar até 15.000 daltons (Da) por segundo e, portanto, é considerado ter propriedades simultâneas de análise multi-elementar. ICP-MS é um método muito sensível que permite a detecção de elementos com concentrações abaixo de partículas per bilhão (ppb), e abaixo de partículas per trilhão (ppt) para certos elementos.

Finalmente, o sistema de detector converte o número de íons atingindo o detector em um sinal elétrico. Utilizando padrões de calibração (amostras de concentração conhecida para um determinado elemento), é possível avaliar a concentração de uma amostra para um ou vários elementos de interesse.

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Procedure

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1. Limpeza de tubos de policarbonato

  1. Use tubos de policarbonato resistentes a soluções ácidas para digestão amostral. Para remover qualquer traço contaminante de ferro, encha todos os tubos com 5 mL de 0,1 M HCl.
  2. Coloque tubos em um banho de água por 1h a 50 °C.
  3. Lave os tubos com 5 mL de água Milli-Q e seque os tubos em um forno ou capô químico.

2. Preparação e Digestão da Amostra

  1. Coloque 200 μL de amostra em 1,8 mL de ácido nítrico concentrado (65%).
  2. Coloque tubos em um banho de água durante a noite a 50 °C. Ajuste o protocolo aumentando a temperatura se for necessária uma redução do tempo geral de digestão.
  3. Deixe os tubos esfriarem à temperatura ambiente.
  4. Diluir as amostras adicionando 8 mL de água Milli-Q para obter uma concentração final de ácido nítrico abaixo de 20% (v/v).
  5. Tubos de centrífugas a 3.000 x g por 10 minutos para pelotar quaisquer resíduos macroscópicos restantes.

3. Preparação do Instrumento

  1. Limpe a tocha ICP usando ultrassônica em ácido nítrico de 5% por 15 min. Limpe os cones com 5% de ácido nítrico. Mude o tubo peristáltico. Verifique o nível de óleo da bomba.
  2. Ligue o argônio e o refrigerador, comece o plasma. Inicie o fluxo líquido no plasma e espere o instrumento estabilizar, cerca de 20 minutos.
  3. Otimize as tensões das lentes. Execute a verificação diária de desempenho medindo soluções de teste contendo Mg, In e você para confirmar a sensibilidade do instrumento ICP-MS. Medida Ce e Ba onde a forma de óxido e íons carregados duplos devem permanecer abaixo de 3%. Verifique a massa em 8 e 220 Da para medir o sinal de fundo.
  4. O instrumento está pronto para uso.

4. Seleção do método do usuário e lista de amostras

  1. Selecione elementos e isótopos de interesse.
  2. Selecione o modo de varredura como salto de pico.
  3. Escolha um tempo de permanência de 100 ms (mínimo 50) com 40 varreduras (mínimo 15) por leitura. Selecione uma leitura por réplica e 5 réplicas (mínimo 3). O tempo total de integração é de 4.000 ms. Se a quantidade de amostra for limitada, reduza o tempo de moradia, o número de varreduras e replique mantendo os valores superiores aos valores mínimos definidos acima.
  4. Use uma taxa de fluxo de amônia (NH3) a 0,7 mL/min para evitar a interferência de 40Ar16O na determinação de 56Fe.
  5. Prepare a curva de calibração para os elementos escolhidos.
  6. Executar as amostras.

A espectrometria de massa é uma técnica analítica que permite a identificação e quantificação de compostos desconhecidos dentro de uma amostra, e a determinação de sua estrutura.

Na espectrometria de massa, íons de fase de gás são gerados a partir dos átomos ou moléculas em uma amostra. Os íons são então separados com base em sua relação massa-carga, simbolizada por m/z.

Essa separação permite a determinação de informações quantitativas e qualitativas sobre uma amostra, como sua massa e estrutura.

Este vídeo introduzirá os conceitos básicos e instrumentação da espectrometria de massa, e demonstrará seu uso na quantificação de elementos.

Um espectrômetro de massa é composto por uma fonte de ionização, um analisador de massa e um detector. Na fonte de ionização, os compostos são ionizados, geralmente a uma única carga positiva.

Íons podem ser gerados usando várias técnicas, como impacto com um feixe de elétrons, plasma ou lasers, cada uma resultando em uma série de fragmentações que auxiliam na determinação da estrutura molecular. Esses métodos são vagamente agrupados em ionização "dura" e "suave".

Técnicas de ionização dura causam fragmentação extensiva, resultando em mais fragmentos de massa inferior.

Técnicas de ionização suave resultam em menos, ou quase não, fragmentação com uma alta faixa de massa molecular.

Se a fragmentação for muito grande, informações valiosas da estrutura podem ser perdidas. Se for muito pouco, pequenas moléculas não serão ionizadas eficientemente. Assim, a seleção de um método de ionização depende do analito de interesse e do grau desejado de fragmentação.

Os íons são então acelerados em um campo elétrico à medida que entram no analisador em massa, onde serão separados.

O analisador de massa mais básico é um setor magnético, que é composto por um ímã curvo que produz um campo magnético homogêneo. A força atraente do ímã, além da força centrífuga dos íons acelerados faz com que eles viajem em um caminho circular através da curva.

O raio do caminho circular dos íons depende da tensão acelerada, do campo magnético aplicado e da relação massa-carga.

A tensão e o campo magnético podem então ser selecionados para permitir apenas certas espécies de relação massa-carga através do caminho curvo. Outros íons batem nos lados da via magnética e estão perdidos. Ao escanear a força do campo magnético, íons desejados chegam ao detector em momentos diferentes, identificando assim cada espécie com precisão.

Outro tipo de analisador de massa é o filtro de massa quadrupole. O quadrupole consiste em dois pares de hastes metálicas paralelas, com cada par de hastes opostas ligadas eletricamente.

Uma tensão de corrente direta é aplicada aos pares de hastes, e seus potenciais continuamente alternados para que os pares estejam sempre fora de fase com o outro.

O feixe de íons é então direcionado através do centro das quatro hastes. Íons viajam em um caminho parecido com um saca-rolhas, devido à constante atração e repulsa das hastes. Dependendo da relação massa-carga de íons, o íon viajará pelo caminho completo do quadrúpole e alcançará o detector, ou colidirá com as hastes.

Agora que o básico do espectrômetro de massa foi descrito, vamos dar uma olhada em seu uso em laboratório.

O espectrômetro de massa usado neste experimento é um plasma indutivamente acoplado, ou ICP, ionizador, com um filtro quadrúpole. O instrumento será usado para detectar e quantificar um componente metálico em uma amostra.

Para começar o experimento, encha todos os tubos de polipropileno com 5 mL de ácido clorídrico de 0,1 M para remover qualquer traço contaminante de ferro. Coloque os tubos em um banho de água por 1h a 50 °C.

Após a incubação, lave os tubos com 5 mL de água desionizada e seque os tubos em um forno ou capô químico.

Nos tubos limpos, adicione 1,8 mL de ácido nítrico concentrado e 200 μL de amostra contendo o isótopo de interesse.

Siga as precauções de segurança ao usar ácido concentrado.

Coloque os tubos em um banho de água durante a noite. A temperatura pode ser aumentada para encurtar o tempo de digestão, se necessário.

Depois que a amostra tiver sido digerida, deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 8 mL de água deionizada para diluir as amostras e obter uma concentração de ácido nítrico abaixo de 20%. A diluição final da amostra é de 1/50. A concentração ideal para iCP está na faixa de partes por bilhão. Centrifugar os tubos para pelotar quaisquer resíduos macroscópicos restantes.

ICP é um método de ionização dura que usa plasma de argônio acoplado a cerca de 10.000 °C que é eletricamente condutor para ionizar as moléculas da amostra.

Inicie o instrumento configurado inspecionando a tocha ICP para garantir que ela esteja limpa.

Em seguida, inspecione o sampler e os cones skimmer para garantir que eles também estejam limpos. Esses cones permitem a amostragem apenas da porção interna do feixe de íons gerado pela tocha ICP e agem como uma barreira ao alto vácuo do espectrômetro de massa.

Verifique a pressão do argônio e inicie o refrigerador. Inicie o plasma e o fluxo líquido para o sistema. Espere 20 min para o sistema se aquecer completamente.

Em seguida, aspire uma solução de teste padrão, que contém vários padrões elementares conhecidos. A solução de teste deve ser selecionada para cobrir a faixa de massa esperada da solução analito.

Quando o fluxo da solução é estabelecido, inicialize e teste o instrumento de acordo com as diretrizes do fabricante.

Para executar o instrumento, primeiro selecione os elementos e isótopos de interesse. Em seguida, ajuste o modo de varredura para o pico de pulando.

Selecione cinco réplicas por medição. Defina cada réplica para conter 40 varreduras de medição, cada varredura com um tempo de moradia de 50 ms. O tempo total de integração é de 2.000 ms por réplica.

Prepare uma curva de calibração para os elementos escolhidos medindo soluções padrão pré-preparadas.

Finalmente, execute a amostra, neste caso, nanopartículas de óxido de ferro. Determine a concentração de ferro usando a curva de calibração de ferro.

A espectrometria de massa é usada em uma ampla gama de aplicações usando várias técnicas de ionização e análise de massa.

Neste exemplo, um tipo de espectrometria de massa de ionização macia, chamada de ionização a laser assistida por matriz, tempo de voo, ou MALDI-TOF, foi usado para analisar proteínas de alto peso molecular. Com o MALDI, as moléculas são estabilizadas com uma matriz, para diminuir o fracionamento quando as grandes moléculas são ionizadas.

A solução proteica e a matriz foram tanto detectadas na placa MALDI limpa, e secas. A placa MALDI foi inserida no instrumento e a amostra analisada.

A análise de compostos sensíveis voláteis e de oxidação foi medida utilizando-se espectrometria de massa de ionização eletrônica, uma técnica de ionização dura.

Primeiro, um sistema de tubos bloqueável foi projetado para permitir a evacuação total do tubo, seguido pelo carregamento da amostra sob resfriamento por nitrogênio líquido.

O tubo de amostra foi conectado à porta de entrada, e a amostra carregada no instrumento. O espectro de massa da amostra, neste caso tris (trifluorometil) fosfato, foi então analisado.

Um espectrômetro de massa de feixe molecular aliado à radiação síncrotron foi usado para explorar a estrutura eletrônica de moléculas e aglomerados de fase de gás.

O feixe molecular, integrado à radiação síncrotron, forneceu um método seletivo de ionização para sondar moléculas na fase gasosa.

A amostra foi carregada no bocal, o bocal recarregado no instrumento, e o feixe de fótons autorizado a entrar na câmara.

O espectro de massa foi então coletado e comparado aos dados de eficiência de fotoionização, a fim de determinar a estrutura eletrônica das moléculas.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à espectrometria em massa. Agora você deve entender a instrumentação básica da espectrometria de massa, e como executar uma análise básica baseada em espectrometria de massa.

Obrigado por assistir!

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Results

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A análise do ICP-MS das amostras contendo nanopartícula de óxido de ferro é mostrada abaixo. Uma curva padrão foi realizada utilizando-se concentração conhecida de 56Fe (Figura 1). O coeficiente de correlação próximo a 1 (R2 = 0,999989) mostrou a boa relação linear entre as concentrações amostrais e a intensidade medida pelo detector. Amostras de interesses mostraram valores dentro da faixa de calibração(Figura 2). As concentrações calculadas pelo software foram então ajustadas de acordo com a diluição realizada durante o protocolo. O presente protocolo descreveu uma diluição de 1/50 após a diluição em ácido (1/10) e na água Mili-Q (1/5). Por exemplo, foi medida uma concentração de 51.427 μg/L para a amostra número 51 (Figura 2). A concentração da amostra original foi 50x maior correspondendo a 2,57 mg/L.

Figure 1
Figura 1. Curva de calibração para 56medições fe. Quatro pontos-padrão (0,01, 0,1, 1 e 10 μg/mL) apresentam coeficiente de correlação(R2)de 0,999989. Isso confirma a boa relação linear entre a intensidade do sinal detectada e as concentrações de referência.

Figure 2
Figura 2. Resultados representativos após as medições do ICP-MS em amostras de nanopartículas de óxido de ferro. A concentração de cada amostra diluída é calculada automaticamente de acordo com a curva de calibração definida.

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Applications and Summary

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Os campos ambiental e geológico representam o primeiro uso do ICP-MS, por exemplo, para medir contaminantes presentes na água, no solo ou na atmosfera. A presença de contaminantes em alta concentração na água da torneira, como Fe, ou Al, pode ser monitorada usando ICP-MS.

Os campos de ciência médica e forense também usam detecção de ICP-MS. Em caso de suspeita de envenenamento por metais como arsênico, amostras como sangue e urina podem ser analisadas utilizando-se iCP-MS. Esta técnica também pode fornecer informações valiosas em caso de patologia envolvendo preocupações metabólicas ou questões hepatológicas que resultem na má excreção de certos elementos.

O ICP-MS permite a quantificação de metais em qualquer material. Na Figura 3,a concentração de Fe foi medida em nanopartículas e relacionada às suas propriedades de ressonância magnética (RM). O ICP-MS fornece uma quantificação confiável de Fe de diferentes nanopartículas para discriminar quais nanopartículas são as mais eficientes para a aplicação de imagens.

Outra aplicação é estudar a biodistribução de nanopartículas associadas aos metais. A Figura 4 apresenta a biodistribução de órgãos de nanopartículas contendo óxido de ferro em camundongos após injeção intravenosa. Às 24h, cada órgão foi coletado e digerido em ácido nítrico concentrado até que a digestão completa dos órgãos fosse alcançada. A concentração de 56Fe foi quantificada pelo ICP-MS. Os resultados mostram maior concentração de 56Fe no fígado e baço para camundongos injetados com nanopartículas do que em órgãos de animais ingênuos. Portanto, concluiu-se que as nanopartículas se acumulam principalmente em órgãos de fígado e baço.

Figure 3
Figura 3. Medição de ressonância magnética (RM) da função das nanopartículas de sua concentração fe. Foram utilizadas cinco concentrações de ferro (0,25, 0,5, 0,75, 1 e 1,25 mM) que foram imagens para suas propriedades de ressonância magnética (taxa de relaxamento, R2*).

Figure 4
Figura 4. Biodistribução de nanopartículas de óxido de ferro após injeção intravenosa em camundongos. Amostras ingênuas mostram o nível de ferro do órgão basal em camundongos não tratados. Após a injeção de nanopartículas contendo óxido de ferro, a quantidade de ferro em determinado órgão aumenta, o que está associado ao acúmulo de nanopartículas.

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