Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Cell Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

זיהוי מיני חמצן תגובתיים
 
Click here for the English version

זיהוי מיני חמצן תגובתיים

Overview

מינים של חמצן תגובתי הם מולקולות פעילות כימית, שמקורן בחמצן המסוגלות לחמצן מולקולות אחרות. בגלל האופי תגובתי שלהם, יש השפעות מזיקות רבות הקשורות לייצור ROS לא בדוק, כולל נזק מבני ל- DNA ומולקולות ביולוגיות אחרות. עם זאת, ROS יכול להיות גם מתווכים של איתות פיזיולוגי. יש ראיות מצטברות כי ROS לשחק תפקידים משמעותיים בכל דבר, החל הפעלה של גורמי שעתוק לתיווך של רעילות דלקתית שהורגת פתוגנים זרים ולהגן על הגוף.

בסרטון זה נתעמק בקשרים בין ROS, חילוף החומרים והמחלות. לאחר ביסוס משמעותם, נדון בעקרונות ובפרוטוקול של מתודולוגיה נפוצה למדידת רמות ROS בתאים: שימוש בבדיקות שאינן פלואורסצנטיות שהופכות לפלואורסצנטיות עם חמצון. לבסוף, נסקור כמה יישומים נוכחיים של טכניקה זו במחקר ביולוגיה של התא.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מינים חמצן תגובתי המיוצרים בתאים היו מעורבים הומאוסטזיס רקמה, הזדקנות הסלולר, ומדינות מחלה כמו סרטן. כפי ששמם מרמז, מולקולות אלה נובעות מחמצן, אשר קיים באופן טבעי כמולקולת דיוקסיגן יציבה מכיוון שכל האלקטרונים שלה משויכים. התוספת של אלקטרון אחד לא מזוקק הופכת אותו לבלתי יציב, ומובילה להיווצרות של אניון סופראוקסיד – צורה של מינים חמצן תגובתיים או ROS. מלבד אניון סופראוקסיד, ישנם מספר סוגים של מינים תגובתיים עם אלקטרונים לא מזווגים, שרמותיהם התא שואף לשלוט בחוזקה.

בסרטון זה, נלמד כיצד מינים תגובתיים של חמצן קשורים לחילוף חומרים ומחלות של תאים, נחקור את העקרונות מאחורי בדיקה לאיתורו באמצעות בדיקה פלואורסצנטית, ונעבור על פרוטוקול כללי לבדיקה זו. לבסוף, נחקור כיצד מדענים מיישמים שיטה זו בניסויים כיום.

ראשית, בואו נדון באופן ייצור מיני חמצן תגובתי, ונשקול את השפעתם בחילוף החומרים של התאים ובמחלות.

מקור משמעותי למינים של חמצן תגובתי תאי הוא המיטוכונדריה. בדרך כלל, במהלך חילוף החומרים של התא אלקטרונים מועברים דרך שרשרת של מתחמי חלבון, שהגיע לשיאו בהפחתת חמצן מולקולרי למים ודור בו זמנית של ATP. למרות הרגולציה יוצאת הדופן של תהליך זה, אלקטרונים דולפים החוצה, וכתוצאה מכך היווצרות של אניון סופר-אוקסיד.

נוכחות של אניון סופראוקסיד מעוררת במהירות צורות אחרות של מינים חמצן תגובתי, כגון מי חמצן ורדיקלים הידרוקסיל. רדיקלים אלה, שלכולם יש אלקטרון לא משוחזר מגיב מאוד, יכולים לפגוע בממברנות, בדנ"א ובחלבונים. כדי לנטרל, התא שומר על מאגר נוגדי חמצון משלו של אנזימים כמו סופראוקסיד דיסמוטאז, או מולקולות כמו ויטמין C, המפחיתות רדיקלים חופשיים. כל חוסר איזון במערכת הגנה זו יכול לגרום לולאת משוב חיובית קטלנית, וכתוצאה מכך מצב של מינים חמצן תגובתי מופרז המכונה עקה חמצונית.

מינים חמצן תגובתי כבר מעורב חניכה והתקדמות של סרטן. השפעה מזיקה נוספת של מולקולות אלה היא אינדוקציה של הזדקנות הסלולר, הידוע גם בשם senescence. "תורת ההזדקנות של הרדיקלי החופשי" מציעה כי מינים חמצן תגובתי המיוצר בתאים במהלך חילוף החומרים הרגיל לעורר הזדקנות תאית ומוות.

עד כה, דנו בהיבטים השליליים של מולקולות תגובתיות אלה, אך יש להן תפקידים חיוביים גם בפיזיולוגיה התאית. במהלך תגובות חיסוניות כאשר פאגוציטים בולעים פתוגנים, תאים מרכיבים "פרץ נשימתי" שבמהלכו נוצרות כמויות מופרזות של מינים חמצן תגובתי כדי להשפיל פתוגנים. בנוסף, הם מתווכים ורגולטורים הכרחיים של מגוון מסלולי איתות תאים, והוא יכול אפילו לאותת על מותם של תאים שהפכו לסרטניים.

כדי לכמת את החמצונים התאיים המשפיעים הללו, מדענים מנצלים מולקולות שעם החמצון הופכות לפלורסנט. בדיקה נפוצה כדי לזהות את מינים חמצן תגובתי הוא H2DCFDA או דיכלורו-דיהידרו-פלואורסצין דיאקאט, אנלוגי לא פלואורסצנטי של פלואורסצין. כאשר נוסף לתאים, טבעו מחלחל לתאים מאפשר לו לפזר באופן פסיבי פנימה.

לאחר מכן, אסטראזות תאיות לזרז תגובה הידרוליזה, אשר התוצאה בקע של קבוצות אצטט. זה הופך את המתחם יותר קוטבי, כך שהוא נשמר בתוך התא. לאחר חמצון, אשר כרוך בהסרת אטומי מימן על ידי מגוון רחב של מינים חמצן תגובתי, H2DCDC שאינו פלואורסצנטי מומר דיכלורו-פלואורסצין פלואורסצנטי מאוד, או DCF. זה יכול להיקרא ולכומת על ידי קורא לוחות, cytometer זרימה, או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

עכשיו שאתה יודע איך זה עובד, בואו לראות איך זה מבוצע בסביבת מעבדה.

התחל על ידי העברת תאים הגדלים בתרבית בינונית לפוספט תמיסת מלח חוצצת, ואחריו צנטריפוגה לשטוף אותם. הסר supernatant, ולהוסיף את הבדיקה פלואורסצנטית H2פתרון DCFDA. לדגור על התאים טעונים בצבע בחושך כדי למנוע הצטננות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים כדי להסיר צבע טעון ולהעביר תאים לצלחת. בשלב זה, ניתן להוסיף תמריצי סטרס חמצוני ניסיוני.

כאשר הם מוכנים לניתוח, ניתן להכניס תאים לקורא הלוחות. אורכי הגל של העירור והפליטה מוגדרים לפלורסצ'ין. לאחר קריאת לוחות, ניתן לנתח ערכים. התוצאות חושפות את הכמות היחסית של מיני חמצן תגובתי בין דגימות בנקודות זמן מסוימות.

עכשיו שבדקנו את הפרוטוקול עצמו, בואו נראה איך הוא מיושם בניסויים היום.

חוקרים לעתים קרובות להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את המכניקה של פאגוציטוזיס. קבוצת מדענים זו רצתה לחקור את יכולתם של דגי הזברה להרכיב תגובה חיסונית בשלבים שונים של התפתחות. כפי שהוזכר קודם לכן, phagocytosis תוצאות הדור של מינים חמצן תגובתי גבוה, או "פרץ נשימתי", המשמש להרוג פתוגנים. מאז האנזים NADPH אוקסידאז הוא מפיק ROS משמעותי בתאים פאגוציטים, מדענים אלה גרמו לתגובת הפרץ על ידי טיפול דגי זברה עם תמריץ NADPH. התוצאות הראו כי בקרב עוברים דגי זברה שתגובתם "התפרצה" עוררה, אלה ב 72 שעות לאחר ההפריה הראו התפתחות מינים חמצן תגובתי גבוה יותר מאשר אלה ב 48 שעות לאחר ההפריה.

תפקוד מיטוכונדריאלי עקב מינים מוגברים חמצן תגובתי הוא תכונה פתולוגית של מחלות רבות. לכן, חוקרים יכולים לזהות תפקוד מיטוכונדריאלי על ידי מדידת רמת הלחץ החמצוני. כאן, מדענים העמיסו H2DCFDA על נוירונים, ולאחר מכן רכוב הדגימות על מיקרוסקופ פלואורסצנטיות. בנוסף של stressor חמצוני, כמו מי חמצן, גופים התא הראו עלייה פתאומית פלואורסצנטיות, אשר יכול להיות אינדיקציה של תפקוד מיטוכונדריאלי.

אסטרוציטים הוצעו כדי להגן על נוירונים במערכת העצבים המרכזית מפני עקה חמצונית. בשל משמעות זו, חוקרים אלה שאפו לפתח בדיקות כדי לזהות סטרס חמצוני אסטרוציטים בנוכחות תמריץ חיצוני. הם עשו זאת על ידי דגירה אסטרוציטים עם מי חמצן ואת הבדיקה פלואורסצנטית לגילוי מינים חמצן תגובתי. פלואורסצנטיות לאחר מכן נוצרה נותחה באמצעות ציטומטר זרימה. אסטרוציטים הופעלו עבור עקה חמצונית נצפו ליפול בתוך אזור של עוצמת פלואורסצנטיות מוגברת, נראה מוזז ימינה.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על גילוי מינים של חמצן תגובתי או ROS. לסיכום, בסרטון זה דנו בקשר בין מינים חמצן תגובתי, חילוף החומרים של התאים, ומחלות. לאחר מכן בדקנו את העיקרון והנוהל של בדיקה לאיתור מינים חמצן תגובתי. לבסוף, חקרנו כיצד חוקרים מיישמים שיטה זו בחקירותיהם. הניתוח של התפקידים המסתוריים עדיין של מינים חמצן תגובתי הוא עניין רב לביולוגים תאים, ומדידה אמינה עם בדיקות פלואורסצנטיות מוכיח להיות לא יסולא בפז. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter