雌性生殖道交配后精子的收集及对小鼠精子液化的测定

本研究的目的是确定如何从雌性生殖道收集交配后精液以及如何测量小鼠的精液液化。本研究中使用的动物是根据华盛顿州立大学动物护理和使用委员会的指导方针并符合 WSU 批准的动物协议 4702 和 4735 进行处理的。在人类中，射出的精液沉积在靠近外宫颈的阴道前壁。

然而，在小鼠中，精液在交配后几分钟内就会被扫入子宫。精液中含有精液凝胶，可在射精后几秒钟内凝固，导致精子被固定。液化过程将精液从凝胶状变为水状稠度。

这个过程对于精子活力和哺乳动物的繁殖至关重要。前列腺特异性抗原或 PSA 的酶活性是通过水解精液中存在的精凝胶或凝胶形成蛋白而液化的主要贡献者。凝胶形成蛋白的降解将精子从精凝物中释放出来，增加了精子的流动性，使精子游向女性生殖道上部，使卵子在输卵管中受精。

本研究中存在的从女性生殖道收集精液的方法和液化时间的测量将为研究人员提供一种新的诊断工具，以确定液化是否可能是感兴趣的模式生物中不孕的原因之一。接下来是小鼠交配和测定阴道栓塞的程序。可以使用标准 C57BL/6 成年雄性小鼠或其他感兴趣的菌株。

仅使用处于周期发情期的雌性。有关阴道涂片和细胞学分析的详细方法，请参阅先前发布的程序。下午 4 点

发情当天，雌性被关在雄性的笼子里。第二天早上 8 点，雌性与雄性的笼子分开。使用无菌扁平牙签，使用改编自先前发表的方法的程序评估是否存在阴道或交配栓沉积作为交配的迹象。

接下来是组织采集前的准备程序。在 15 毫升试管中制备 10 毫升补充有 1% 胎牛血清的 Leibovitz's L-15 培养基，或 L-15 培养基加 1% FBS。将介质在 37 摄氏度下加热 15 分钟。

为了在下游应用中保持组织和精子的活力，将 2 mL 培养基分装在 2 mL 试管中用于组织收集。将立体显微镜的载物台加热至 37 摄氏度。将加热块设置为 37 摄氏度。

将空管放入加热块中。如果下游应用需要精子活力成像，也要将载玻片加热至 37 摄氏度。接下来是组织采集的程序。

以下是将用于组织采集的工具。检查栓塞后立即对雌性实施安乐死，先使用二氧化碳窒息，然后进行宫颈脱位。将动物置于仰卧位以露出腹部区域。

将 70% 乙醇喷洒在腹部。在下腹部的皮肤上做一个大约 1 厘米的小切口。向相反方向拉动尾巴和皮肤，露出腹部肌肉。

在腹部底部将腹肌切成 V 形。将肠道和腹部脂肪移至一侧，露出生殖道。修剪阴道区域上方的膀胱和其他组织。

将耻骨联合切开以进入阴道组织。使用管钳拉动耻骨联合结合部分，露出阴道管。提起阴道口处的阴道组织，用剪刀将阴道管与下面的直肠组织分开。

用弹簧剪刀小心地修剪子宫两侧的肠系膜脂肪。子宫里面有精液，非常脆弱。因此，研究者应注意不要刺穿子宫，否则精液会丢失。

从卵巢两侧切掉卵巢脂肪垫。将整个生殖道转移到预热培养基的试管中。接下来是精液液化的测量方法。

以下是精液采集工具。将 3 毫升温热培养基转移到 3.5 厘米的培养皿中。将组织转移到培养皿中。

抓住脂肪垫将组织清洗数次。此时，精液在子宫内应该仍然完好无损。在 Kimwipes 上吸干组织以去除多余的介质。

将组织保持在阴道末端，然后将卵巢末端提起空管内，将组织放入预热的管中。切开阴道和子宫之间的两个子宫角。让精液从子宫角流出进入管子。

使用无齿镊子轻轻挤压并排出子宫角中剩余的精液。短暂地将精液旋转 1 到 2 秒。将管子平行于加热台放置。

将 25 μL 毛细管以 180 度角插入精液样品中。这是为了最大限度地减少每个研究者因以不同角度握住毛细管而产生的差异。记录精液达到 25 微升线所需的时间。

化时间由用精液填充 25 μL 毛细管所需的时间来定量。从对照子宫收集的精液大约需要两分钟才能充满毛细管。然而，从敲除子宫中收集的精液需要超过 60 分钟的实验时间。

这些数据表明，与敲除子宫相比，对照组中的精液液化程度明显更高。这是使用精子活力视频成像的下游应用示例之一。使用移液器吸头将 25 微升剩余精液移液到预热的载玻片上，同时将载玻片放置在加热台上。

用玻璃盖玻片盖玻片。将载玻片盖玻片向下，将载玻片转移到显微镜上。使用 20 倍物镜找到精子。

然后改用 100 倍物镜进行视频成像。以每秒 12 帧的速度录制视频，持续 30 秒。从对照子宫收集的精液显示精子在微观区域内自由游动。

然而，从敲除子宫收集的精液显示，大多数精子聚集在一起，活动性最小。这些发现表明，交配后 8 小时从女性生殖道收集的精液可用于进一步分析。除了这些下游应用外，研究人员还可以评估干扰精子运输不同过程的感兴趣抑制剂或化合物的效果，例如精子液化、精子在肠道中的精子数量、精子活力或精子迁移在女性生殖道的不同区域。

这些化合物可以在交配前施用于女性生殖道。然后，可以从交配后的精液样本中评估这些抑制剂或化合物的影响。这种方法可用于测试抑制精子运输的避孕药的实用性。