Overview
התגבשות חלבונים, קבלת סריג מוצק של ביומולקולים, מבהירה את מבנה החלבון ומאפשרת לחקור את תפקוד החלבון. התגבשות כרוכה בייבוש חלבון מטוהר תחת שילוב של גורמים רבים, כולל pH, טמפרטורה, חוזק יוני וריכוז חלבונים. לאחר קבלת הגבישים, מבנה החלבון יכול להיות מואר על ידי עקיפה של קרני רנטגן וחישוב של מודל צפיפות אלקטרונים.
וידאו זה מציג התגבשות חלבון ומציג הליך כללי. ביטוי חלבון וטיהור, התגבשות, עקיפה של קרני רנטגן מכוסים בהליך. יישומים של התגבשות חלבון כוללים בעיצוב תרופה סיליקו, קביעת אתר מחייב, וניתוח מבנה חלבון ממברנה.
התגבשות חלבונים היא תהליך של השגת צורה מוצקה סותרת של חלבון. גבישים אלה הם בעלי ערך מיוחד לביולוגים מבניים, ומסייעים בחקר תפקוד החלבון. טכניקות אחרות, כגון מפרט מסה או SDS-PAGE, יכולות לספק מידע רק על המבנה החד-ממדי של חלבונים. התגבשות חלבונים משלימה את הטכניקות של ביטוי חלבון רקומביננטי עקיפה של קרני רנטגן. וידאו זה יציג את עקרונות התגבשות החלבון, הליך מעבדה כללי, וכמה מיישומיו בתחום הביוכימי.
הצעד הראשון הנדרש בתהליך הוא להשיג כמויות מיליגרם של חלבון טהור מאוד, בדרך כלל באמצעות ביטוי חלבון רקומביננטי. הגן המתאים לחלבון העניין משוכפל לווקטור ביטוי, והחלבון המבוטא מותך לתג זיקה, כגון פולי-היסטידין, כדי לסייע בטיהור על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. למידע נוסף, עיין בסרטון של אוסף זה על כרומטוגרפיה של זיקה.
היווצרות החלבון המטוהר לגבישים תלויה בשילוב הנכון של גורמים רבים, כולל pH, חוזק יוני, ריכוזים של משקעים וחלבון, טמפרטורה וקצב של שאיון. השיטה הנפוצה ביותר בשימוש היא דיפוזיה אדים, אשר ישנן שתי קטגוריות: תלייה טיפה וירידה בישיבה. טיפה המכילה חלבון טהור, חיץ ומים, שהיא מוצק יוני הקושר מולקולות מים, מפחיתה את זמינות המים לחלבון ומחקה ריכוז חלבון גבוה יותר, נמצאת במיקרווול סגור עם מאגר עם תערובת מרוכזת יותר של אותו חיץ ומשקעים. בהתחלה, ריכוזי החלבון והמים נמוכים מכדי לגרום להתגבשות. במהלך הניסוי, מים מתאדים מהטיפה ונאספים במאגר; ירידה בכמות המים בטיפת גורמת למערכת להיות רוויה, וההתגבשות, ואחריה התגבשות, יכולה להתרחש. ההעברה נטו של מים מהטיפה נמצאת בשיווי משקל, והמערכת נשמרת עד להשלמת התהליך.
כדי להציג באופן חזותי את המבנה התלת-ממדי, נעשה שימוש בעקיפת קרני רנטגן. כדי לקבל נתוני רנטגן מקריסטל, הוא ממוקם בקרן רנטגן מונוכרומטית, שם הוא חשוף לקרן בכל הזוויות. כל חשיפה מספקת תמונה, שבה כל נקודה היא צילום רנטגן מפוזר, שיוצא מהגביש ונרשם על ידי גלאי. הנתונים משולבים כדי לייצר מודל של סידור האטומים בתוך הגביש. מבנה הגביש המתקבל מדגים את המיקום התלת מימדי של האטומים, ברזולוציה אופיינית של 2 אנגסטרום.
כעת, לאחר שכיסינו את עקרונות התגבשות החלבון, הבה נבחן פרוטוקול כללי.
כדי להתחיל את ההליך וקטור ביטוי המכיל את גן העניין הופך לתאים. התאים דוגרים ובאמצע יומן הרישום, הביטוי מופעל על ידי הוספת תמריץ, כגון IPTG, מה שמפעיל את שעתוק ה- mRNA של הגן. לאחר ביטוי חלבון, החומר הגולמי מושעה במאגר תמוגה, ולאחר מכן הובהר על ידי צנטריפוגה.
לאחר מכן, הליסאט המובהר נטען על עמוד ניקל, והחלבון המתויג בפוליהיסטידין נקשר לעמודה בזמן שכל הביומולקולים האחרים נשטפים.
לאחר כמה מיליגרם של חלבון טהור הושגו, הוא מוכן להתגבש על ידי דיפוזיה אדים. מגש טיפה תלוי/יושב 24 היטב מלא בריכוזים שונים של פתרונות חיץ נתרן כלורי ונתרן אצטט. עבור שיטת טיפת הישיבה, כמויות שוות של חלבון ופתרון מאגר מועברים על המדף מעל כל באר, ולאחר מכן המגש מכוסה בסרט שקוף. המגש ממוקם לאחר מכן בתא דגירה, והברות מנוטרות לצמיחה למחרת, ואז כל כמה ימים.
לאחר גבישי מתאים הושג הוא מוכן לניתוח עקיפה רנטגן. הגביש מותקן על גוניומטר כדי למקם את הגביש באוריינטציות נבחרות. הגביש מואר בקרן מונוכרומטית של צילומי רנטגן בכל הזוויות, ומייצר תבנית עקיפה. התוכנה ממירה את התמונות הדו-ממדיות, שצולמו באוריינטציות שונות, למודל תלת מימדי של צפיפות האלקטרונים בתוך הגביש על ידי קביעת מיקומי האטומים בגביש.
עכשיו שבדקנו הליך, בואו נסקור כמה יישומים שימושיים של התגבשות חלבונים, וטכניקת התגבשות נוספת.
התגבשות חלבון עשויה לשמש בעיצוב תרופות סיליקו. המבנה התלת מימדי של חלבון בסיסי פולימראז של נגיף השפעת 2, אשר נקשר לזיהום ויראלי ביונקים, נקבע על ידי התגבשות עקיפה של קרני רנטגן. אתרי כריכה פוטנציאליים בחלבון דמיינו, ועם השימוש בתוכנית עגינה, תוכננה מולקולה תלת ממדית שתכניס לשסע בחלבון.
התגבשות משותפת של קומפלקסים של חלבון-DNA היא גם טכניקה שימושית. חלבונים מחייבי דנ"א מווסתים מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות כגון שעתוק ופימור DNA ותיקון DNA; ומבני קריסטל של מתחמים אלה יכולים לספק תובנה על תפקוד החלבון, המנגנון ואופי האינטראקציה הספציפית. החלבון E. coli SeqA, רגולטור שלילי של שכפול DNA, התגבש במשותף עם DNA המימתילציה.
חלבונים ממברנה אינטגרליים כגון קולטנים מצמידים לחלבון G, או GCPRs, קשה לגבש בשל הכמות המוגבלת שלהם של שטח הפנים הקוטבי הזמין ליצירת מגעים סריג קריסטל, אשר הוביל לפיתוח של היתוך-חלבון בסיוע חלבון התגבשות חלבון. גנים קידוד β2 קולטן adrenergic, GCPR, וליזוזים הוכנסו לתוך וקטור ביטוי. התגבשותו של חלבון ההיתוך β2AR-lysozyme הושגה בשל המשטח ההידרופילי החוץ-תאי המוגבר מעל β2AR ההידרופובי הטבעי, המסופק על ידי ליזוזים, הדרוש ליצירת אינטראקציות אריזה בסריג הקריסטל.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על התגבשות חלבונים. סרטון זה תיאר את עקרונותיו, פרוטוקול כללי, וחלק מהשימושים בו בתחום הביו-רפואי. תודה שצפיתם!
Procedure
התגבשות חלבונים, קבלת סריג מוצק של ביומולקולים, מבהירה את מבנה החלבון ומאפשרת לחקור את תפקוד החלבון. התגבשות כרוכה בייבוש חלבון מטוהר תחת שילוב של גורמים רבים, כולל pH, טמפרטורה, חוזק יוני וריכוז חלבונים. לאחר קבלת הגבישים, מבנה החלבון יכול להיות מואר על ידי עקיפה של קרני רנטגן וחישוב של מודל צפיפות אלקטרונים.
וידאו זה מציג התגבשות חלבון ומציג הליך כללי. ביטוי חלבון וטיהור, התגבשות, עקיפה של קרני רנטגן מכוסים בהליך. יישומים של התגבשות חלבון כוללים בעיצוב תרופה סיליקו, קביעת אתר מחייב, וניתוח מבנה חלבון ממברנה.
התגבשות חלבונים היא תהליך של השגת צורה מוצקה סותרת של חלבון. גבישים אלה הם בעלי ערך מיוחד לביולוגים מבניים, ומסייעים בחקר תפקוד החלבון. טכניקות אחרות, כגון מפרט מסה או SDS-PAGE, יכולות לספק מידע רק על המבנה החד-ממדי של חלבונים. התגבשות חלבונים משלימה את הטכניקות של ביטוי חלבון רקומביננטי עקיפה של קרני רנטגן. וידאו זה יציג את עקרונות התגבשות החלבון, הליך מעבדה כללי, וכמה מיישומיו בתחום הביוכימי.
הצעד הראשון הנדרש בתהליך הוא להשיג כמויות מיליגרם של חלבון טהור מאוד, בדרך כלל באמצעות ביטוי חלבון רקומביננטי. הגן המתאים לחלבון העניין משוכפל לווקטור ביטוי, והחלבון המבוטא מותך לתג זיקה, כגון פולי-היסטידין, כדי לסייע בטיהור על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. למידע נוסף, עיין בסרטון של אוסף זה על כרומטוגרפיה של זיקה.
היווצרות החלבון המטוהר לגבישים תלויה בשילוב הנכון של גורמים רבים, כולל pH, חוזק יוני, ריכוזים של משקעים וחלבון, טמפרטורה וקצב של שאיון. השיטה הנפוצה ביותר בשימוש היא דיפוזיה אדים, אשר ישנן שתי קטגוריות: תלייה טיפה וירידה בישיבה. טיפה המכילה חלבון טהור, חיץ ומים, שהיא מוצק יוני הקושר מולקולות מים, מפחיתה את זמינות המים לחלבון ומחקה ריכוז חלבון גבוה יותר, נמצאת במיקרווול סגור עם מאגר עם תערובת מרוכזת יותר של אותו חיץ ומשקעים. בהתחלה, ריכוזי החלבון והמים נמוכים מכדי לגרום להתגבשות. במהלך הניסוי, מים מתאדים מהטיפה ונאספים במאגר; ירידה בכמות המים בטיפת גורמת למערכת להיות רוויה, וההתגבשות, ואחריה התגבשות, יכולה להתרחש. ההעברה נטו של מים מהטיפה נמצאת בשיווי משקל, והמערכת נשמרת עד להשלמת התהליך.
כדי להציג באופן חזותי את המבנה התלת-ממדי, נעשה שימוש בעקיפת קרני רנטגן. כדי לקבל נתוני רנטגן מקריסטל, הוא ממוקם בקרן רנטגן מונוכרומטית, שם הוא חשוף לקרן בכל הזוויות. כל חשיפה מספקת תמונה, שבה כל נקודה היא צילום רנטגן מפוזר, שיוצא מהגביש ונרשם על ידי גלאי. הנתונים משולבים כדי לייצר מודל של סידור האטומים בתוך הגביש. מבנה הגביש המתקבל מדגים את המיקום התלת מימדי של האטומים, ברזולוציה אופיינית של 2 אנגסטרום.
כעת, לאחר שכיסינו את עקרונות התגבשות החלבון, הבה נבחן פרוטוקול כללי.
כדי להתחיל את ההליך וקטור ביטוי המכיל את גן העניין הופך לתאים. התאים דוגרים ובאמצע יומן הרישום, הביטוי מופעל על ידי הוספת תמריץ, כגון IPTG, מה שמפעיל את שעתוק ה- mRNA של הגן. לאחר ביטוי חלבון, החומר הגולמי מושעה במאגר תמוגה, ולאחר מכן הובהר על ידי צנטריפוגה.
לאחר מכן, הליסאט המובהר נטען על עמוד ניקל, והחלבון המתויג בפוליהיסטידין נקשר לעמודה בזמן שכל הביומולקולים האחרים נשטפים.
לאחר כמה מיליגרם של חלבון טהור הושגו, הוא מוכן להתגבש על ידי דיפוזיה אדים. מגש טיפה תלוי/יושב 24 היטב מלא בריכוזים שונים של פתרונות חיץ נתרן כלורי ונתרן אצטט. עבור שיטת טיפת הישיבה, כמויות שוות של חלבון ופתרון מאגר מועברים על המדף מעל כל באר, ולאחר מכן המגש מכוסה בסרט שקוף. המגש ממוקם לאחר מכן בתא דגירה, והברות מנוטרות לצמיחה למחרת, ואז כל כמה ימים.
לאחר גבישי מתאים הושג הוא מוכן לניתוח עקיפה רנטגן. הגביש מותקן על גוניומטר כדי למקם את הגביש באוריינטציות נבחרות. הגביש מואר בקרן מונוכרומטית של צילומי רנטגן בכל הזוויות, ומייצר תבנית עקיפה. התוכנה ממירה את התמונות הדו-ממדיות, שצולמו באוריינטציות שונות, למודל תלת מימדי של צפיפות האלקטרונים בתוך הגביש על ידי קביעת מיקומי האטומים בגביש.
עכשיו שבדקנו הליך, בואו נסקור כמה יישומים שימושיים של התגבשות חלבונים, וטכניקת התגבשות נוספת.
התגבשות חלבון עשויה לשמש בעיצוב תרופות סיליקו. המבנה התלת מימדי של חלבון בסיסי פולימראז של נגיף השפעת 2, אשר נקשר לזיהום ויראלי ביונקים, נקבע על ידי התגבשות עקיפה של קרני רנטגן. אתרי כריכה פוטנציאליים בחלבון דמיינו, ועם השימוש בתוכנית עגינה, תוכננה מולקולה תלת ממדית שתכניס לשסע בחלבון.
התגבשות משותפת של קומפלקסים של חלבון-DNA היא גם טכניקה שימושית. חלבונים מחייבי דנ"א מווסתים מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות כגון שעתוק ופימור DNA ותיקון DNA; ומבני קריסטל של מתחמים אלה יכולים לספק תובנה על תפקוד החלבון, המנגנון ואופי האינטראקציה הספציפית. החלבון E. coli SeqA, רגולטור שלילי של שכפול DNA, התגבש במשותף עם DNA המימתילציה.
חלבונים ממברנה אינטגרליים כגון קולטנים מצמידים לחלבון G, או GCPRs, קשה לגבש בשל הכמות המוגבלת שלהם של שטח הפנים הקוטבי הזמין ליצירת מגעים סריג קריסטל, אשר הוביל לפיתוח של היתוך-חלבון בסיוע חלבון התגבשות חלבון. גנים קידוד β2 קולטן adrenergic, GCPR, וליזוזים הוכנסו לתוך וקטור ביטוי. התגבשותו של חלבון ההיתוך β2AR-lysozyme הושגה בשל המשטח ההידרופילי החוץ-תאי המוגבר מעל β2AR ההידרופובי הטבעי, המסופק על ידי ליזוזים, הדרוש ליצירת אינטראקציות אריזה בסריג הקריסטל.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על התגבשות חלבונים. סרטון זה תיאר את עקרונותיו, פרוטוקול כללי, וחלק מהשימושים בו בתחום הביו-רפואי. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
