Cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi

L'obiettivo generale di questo saggio di aggregazione è valutare il legame del recettore di Notch con i trans-ligandi e la sua inibizione da parte dei cis-ligandi. Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave: in che modo il fattore genetico o farmacologico influenzerà il legame del recettore di Notch al suo ligando e altererà la segnalazione? Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di valutare il legame trans e cis del recettore di Notch con il suo ligando.

È interessante notare che non coinvolge l'effetto di sovrapposizione del ligando endogeno. Iniziare la valutazione facendo girare le celle che ricevono il segnale e risospendendole nel mezzo di Schneider. Contare le cellule manualmente utilizzando un ematocitometro.

Piastra cinque volte 10 al quinto S2 e celle S2-Notch stabili in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, in un millilitro per pozzetto di terreno di Schneider. Quindi, aggiungi 7,5 microgrammi di RNA a doppio filamento in ciascun pozzetto e incuba le cellule a 25 gradi Celsius per 24 ore. Aggiungere 0,7 millimolari di solfato di rame per indurre l'espressione di Notch e incubare le cellule a 25 gradi Celsius per tre giorni.

Dopo l'incubazione, contare manualmente le cellule che inviano il segnale utilizzando un ematocitometro. E piastra cinque volte 10 alla sesta cella stabile in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, in un millilitro per pozzetto di Schneider's Medium integrato. Quindi aggiungere 0,7 millimolari di solfato di rame per indurre l'espressione dei ligandi e incubare le cellule a 25 gradi Celsius per tre ore.

Raccogliete le cellule S2-control e S2-Notch trattate con RNA a doppio filamento mediante pipettaggio delicato. E piastra 2,5 volte 10 alla quinta cella per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere cinque volte 10 alla quinta cellula stabile di pomodoro S2-Delta o S2-Serrato per un volume totale di 200 microlitri di Schneider's Medium integrato.

Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a 150 giri/min. Dopo un minuto, mescolare il contenuto di ogni pozzetto e prelevare 20 microlitri per contare il numero di aggregati. Contemporaneamente, scatta un'immagine rappresentativa con un microscopio composto invertito utilizzando un ingrandimento 10x.

Per visualizzare le cellule, posizionare la fotocamera sul microscopio e connettersi con il software per acquisire l'immagine. Contare manualmente gli aggregati utilizzando un ematocitometro. Posizionare il piatto sullo shaker.

Ripetere l'acquisizione e il conteggio dell'immagine dopo cinque minuti e 15 minuti di aggregazione. Eseguire la quantificazione trans-legante calcolando il numero di aggregati per millilitro tra le cellule S2 e le cellule di pomodoro S2-Delta o S2-Serrate come controllo di fondo e il numero di aggregati per millilitro tra le cellule di pomodoro S2-Notch e S2-Delta o S2-Serrate. Preparare le cellule di ricezione del segnale piastrando cinque volte da 10 a 5 cellule S2 in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, in un millilitro per pozzetto di Schneider's Medium integrato.

Aggiungere 7,5 microgrammi di RNA a doppio filamento in ciascun pozzetto e incubare la piastra a 25 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, cotrasfettare le cellule trattate con RNA a doppio filamento per una concentrazione totale di DNA di due microgrammi per pozzetto utilizzando un reagente di trasfezione commerciale. Incubare le cellule S2 trasfettate transitoriamente a 25 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno successivo, aggiungere 0,7 millimolari di solfato di rame per indurre l'espressione di Notch e dei leganti e incubare a 25 gradi Celsius per tre giorni. Preparare le celle di invio del segnale come descritto nella sezione precedente. Infine, eseguire l'aggregazione tra le celle di invio e ricezione del segnale, come descritto in precedenza.

È stato osservato un forte aumento del numero di aggregati tra uno e cinque minuti. Poi il numero di aggregati ha continuato ad aumentare fino a 30 minuti, a un ritmo più lento. Le immagini che mostrano l'aggregazione in tre punti temporali mostrano che le cellule S2-Notch trattate con RNA a doppio filamento EGFP hanno formato aggregati con cellule S2-Delta, che aumentano di numero con il tempo.

Al contrario, gli sham e le cellule S2-Notch trattate con RNA a doppio filamento formavano aggregati più velocemente e gli aggregati erano più grandi e in numero maggiore. Indicando che la diminuzione dei livelli di sham ha migliorato il trans-legame di Notch con Delta. La trasfezione di quantità uguali di costrutti di espressione Notch e Delta nelle cellule S2 riduce drasticamente il numero di aggregati formati tra queste cellule e le cellule S2-Delta.

Inoltre, la diminuzione della quantità di cis-Delta si traduce in un aumento del numero di aggregati. Ciò indica che nell'intervallo dei rapporti Notch/cis-Delta utilizzati in questi saggi, il cis-Delta può inibire il legame tra Notch e trans-Delta in modo dipendente dal dosaggio. La quantificazione dell'aggregazione relativa ha mostrato un'inibizione comparabile dell'aggregazione al trattamento con EGFP e shams con RNA a doppio filamento.

Una volta preparati tutti i reagenti, questo test è semplice e può essere eseguito in poche ore.