Name: Automáticos de medição de criptocócica espécie polissacarídeo cápsula e corpo celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a automatizar medições de cápsula e corpo celular em Cryptococcus neoformans usando processamento de imagens. Esta técnica computacional melhora a eficiência e precisão na análise de grandes volumes amostrais.

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Nós gostaríamos de reconhecer Anthony Bowen cujos slides foram usados como uma segunda comparação lado-a-lado humana, bem como Sabrina Nolan cujos slides foram usados como um terceiro lado-por-lado humano e segundo microscópio de comparação.

1. preparação de tinta nanquim Slide
<ol><li>Pipete 10 µ l de amostra criptocócica numa lâmina. Qualquer levedura circular irá funcionar, mas para este experimento H99 foi a única estirpe utilizada. Nota: Se a amostra for directamente a partir de meios de cultura, diluição 1:2 com PBS ou água pode ajudar a prevenir a tinta da Índia de aglutinação.</li>
	<li>Pipetar 2 µ l de mancha de tinta da Índia para a amostra e misture fisicamente empurrando a ponta da pipeta para a amostra e movendo-se em movimentos circulares até que a tinta da Índia aparece uniformemente distribuída.</li>
	<li>Coloque uma lamela sobre a amostra, pressionando a borda esquerda da lamela contra a superfície da lâmina, então delicadamente e uniformente abaixando o lado oposto da lamela da amostra.</li>
	<li>O slide para o ar deixe secar por 5 min.</li>
	<li>Aplica suavemente uma leve camada de verniz para fronteira lamela para formar um selo e preservar a mancha de tinta nanquim.</li>
</ol>2. Slide de imagem
<ol><li>Coloque slides em um microscópio de campo claro com um acessório de câmera e conversão de pixel-a-micron conhecido. Ajuste contraste, objectivos e filtros para que cápsulas de célula são claras e corpos celulares são bandas focadas, escuras. Nota: Vários filtros, objectivos e configurações de contraste vão trabalhar, mas recomenda-se um 20 x objetivo, Ph1 filtro e binning 2x2.</li>
	<li>Certifique-se que o campo de visão é denso mas não superpovoado com células criptocócica, com claro contraste entre a cápsula de célula e plano de fundo e devidamente concentrado com o corpo de célula visualizado como uma banda escura. Nota: O número exato de células para uma imagem ideal pode variar dependendo da amostra e o objetivo sendo usado. Os aspectos importantes são para células não sejam agrupados ou sobrepostos, que os aviões focal de célula não variam significativamente, e que há significativa Nanquim mancham claramente visível no plano de fundo (pelo menos 25% do campo).</li>
	<li>Salve imagens em um único diretório com títulos claros, como o algoritmo de medição será executado em imagens em um único diretório e os dados de saída serão organizados de acordo com os nomes dos arquivos de imagem.</li>
</ol>3. algoritmo Setup
<ol><li>Instalar a versão do Python 2.7 de</li>
	<li>Instalar bibliotecas python adicionais executando os comandos "pip install travesseiro" e "pip install openpyxl".</li>
	<li>Instalar o MATLAB, seguindo as instruções no</li>
	<li>Compilar a biblioteca python MATLAB, seguindo as instruções fornecidas no https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.</li>
	<li>Baixe os três arquivos necessários incluídos em materiais suplementares a este manuscrito ("QCA.py", "Analysis2.m" e "TestRun.m"). Nota: Esses arquivos podem ser extraídos para qualquer local, mas todos os três devem estar no mesmo diretório.</li>
</ol>4. utilização do algoritmo
<ol><li>Execute o aplicativo clicando duas vezes em QCA.py. Nota: A aplicação pode levar alguns minutos para começar. O arquivo "QCA.py" contém a estrutura de programa que chama os arquivos ". m" para executar o algoritmo real.</li>
	<li>Siga as etapas descritas no programa.<ol>
<li>Entrada, o tipo de extensão de arquivos de imagem, precedido por um ponto e separados por ponto e vírgula (ex. ". TIF;. JPEG") em seguida clique no botão Enter .</li>
		<li>Escolha o diretório no qual os arquivos de imagem estão localizados clicando no botão Selecionar diretório e selecionando a pasta que contém as imagens.</li>
		<li>Gera a lista de arquivos de imagem no diretório clicando no botão Gerar lista de imagem . As imagens serão listadas na caixa de texto à direita. Revisar e assegurar que a lista é exacto e completo.</li>
		<li>Selecione uma imagem aleatória da lista para usar como uma visualização clicando no botão Selecionar imagem aleatória . Nota: Se a imagem for não é possível abrir devido a um erro de modo"imagem incorreta", o algoritmo ainda funcionará correctamente apesar de não exibir a imagem. Após a etapa 4.2.7, ainda exibirá a imagem de teste.</li>
		<li>Objetivo do microscópio e binning configurações de entrada. Se as configurações padrão não coincidem com o microscópio usado, selecione "Custom Pixel conversão" e a conversão de pixel-para-um para os arquivos de imagem de entrada. Uma vez selecionado, clique no botão Calcular conversão e assegurar que a conversão está correta de acordo com a caixa de texto à direita. Nota: Imagens representativas, mostradas na Figura 1 foram calculadas com 40 x ampliação e 2x2 binning selecionado.</li>
		<li>Parâmetros de algoritmo para a deteção do círculo de entrada.<ol>
<li>Entrada do raio máximo e mínimo detectável para a deteção da cápsula externa como as entradas de Min e Max cápsula Radius. Um intervalo menor permitirá obter resultados mais precisos.</li>
			<li>Entrada do raio mínimo e máximo detectável para detecção do corpo celular como as entradas de Min e Max corpo celular Radius. Nota: Todos os quatro dessas entradas devem ser números representando seus respectivos valores em pixels, de acordo com as imagens de origem.</li>
			<li>Mova os controles deslizantes de cápsula e sensibilidade do corpo celular para ajustar o limiar de sensibilidade do algoritmo. Uma baixa sensibilidade será rigorosa e reduzir a deteção do círculo positivo falso, mas também pode detectar círculos reais menos. Por outro lado, uma alta sensibilidade aumentará a taxa de detecção, mas também pode resultar em falsos positivos círculos. Nota: Resultados representativos foram obtidos com um raio mínimo de cápsula de 7 raio máximo de cápsulas de 45, raio de corpo mínimo de 4, raio máximo de corpo de 30, cápsula sensibilidade de 87 e a sensibilidade do corpo de 87.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Teste os parâmetros na imagem aleatoriamente selecionado clicando no botão Executar teste . O resultado será exibido no centro superior do programa, substituindo a imagem original. Se os resultados precisos, é recomendável para selecionar uma imagem aleatória adicional para tentar garantir que os parâmetros selecionados vão caber todas as imagens selecionadas também.<ol>
<li>Maximizar o número de corpos e cápsulas detectado e inspecionam visualmente se os círculos parecem caber corretamente. O número de corpos dentro de cápsulas detectados será exibido na caixa de texto à direita. Caso contrário, manipule os parâmetros de algoritmo até que os resultados são precisos. Nota: Os espesso círculos coloridos são apenas para ajudar com a visualização. Os círculos reais gerados para medição é uma curva matemática calculada pelo algoritmo HCT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Execute o algoritmo de detecção em todo o diretório de arquivos de imagem clicando no botão Iniciar análise . Cada imagem será analisada e o programa irá exibir "terminado" na caixa de texto para a direita quando todas as imagens foram analisadas.</li>
		<li>Clique no botão de partida e limpeza . Isto corresponder detectados corpos celulares para as cápsulas detectados que residem no e calcular o raio da cápsula verdadeiro subtraindo o corpo da cápsula. Nota: Se o algoritmo está sendo usado para detectar fluorescência ou outra situação em que apenas um círculo é detectado este passo é desnecessário. Em vez disso, clique os Corpos apenas puxar ou o botão de Cápsulas só puxar para coletar os dados para somente o azul ou só os círculos verdes, respectivamente. É importante notar que se apenas os dados da cápsula são recuperados o raio irá se referir o raio total da célula como o raio do corpo celular não poderia ser subtraído.</li>
		<li>Localize os dados concluídos no arquivo "CleanedOuput.csv" no diretório de imagens. Se apenas uma parte dos dados foi seleccionada, o arquivo será rotulado "CleanedBodies.csv" ou "CleanedCapsules.csv".</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li>
<li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii%2C+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).</li>
<li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).</li>
<li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.neurology.org/content/80/7_Supplement/P04.007">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).</li>
<li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
<li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li>
<li>Araujo, G. deS., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561(2012).</li>
<li>García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+CAP59+%28or+Cap59p%29+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li>
<li>Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2891871/">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li>
<li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC219591/">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li>
<li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Os passos críticos desta técnica estão preparando o slide de tinta nanquim e aquisição de imagens do microscópio. Enquanto o algoritmo foi testado com êxito com uma variedade de técnicas de slide e imagem o protocolo recomendado é descrito neste manuscrito. A cápsula de polissacarídeo é detectada com base na exclusão de partículas de tinta da Índia do domínio da cápsula como estas partículas são muito grandes para penetrar a rede de fibrila de polissacarídeo. Exclusão de Nanquim resulta em um círculo brilhante em cima de...

Cryptococcus neoformans é uma levedura patogênica ubiquitously encontrada ao redor do globo que está associado com doença humana principalmente em populações de imunossuprimidos. C. neoformans mais notavelmente representa uma importante causa de mortes anuais totais na África subsahariana devido a doenças infecciosas1. A principal manifestação clínica de infecção criptocócica é meningoencefalite, que segue a invasão do sistema nervoso central de transportes em macrófagos infectados (forma de cavalo de Troia) ou cruzamento direto da barreira sangue - cérebro. C. neoformans manifesta vários fatores de virulência, incluindo a capacidade de replicar na temperatura do corpo humano, a atividade da urease, melanização e formação de uma cápsula de polissacarídeo2. A cápsula de polissacarídeo é composta de repetição glucuronoxylomannan e glucoronoxylomannangalactan de polímeros e funções como uma barreira protetora contra fatores como estresse ambiental e de respostas imunes do hospedeiro2.
Embora o tamanho do tamanho da cápsula de polissacarídeo criptocócica não foi consistentemente associado com virulência, há provas de que é um fator na patogênese2,3,4,5, 6,7. Cápsula tamanho está associado a meningite patologia6, pode afetar a capacidade de macrófago para controlar a infecção de Cryptococcus 5e pode resultar em perda de virulência se ausente8. Daí, medições do tamanho da cápsula são comuns em pesquisa criptocócica, mas não há nenhum fieldwide padrão para um método de medição da cápsula.
Atualmente, c. neoformans polissacarídeo cápsula medida baseia-se na medição manual de imagens de microscopia, e os métodos exatos de aquisições tanto imagem e medição variam entre laboratórios9,10, 11. Uma preocupação imediata para este método é que alguns estudos exigem a aquisição de milhares de medições individuais, o que torna difícil a manutenção de precisão e confiabilidade. Além disso, mesmo quando os resultados são publicados, lá é muitas vezes insuficiente descrição do método de medição. Muitas publicações não explicam como foram obtidas as medidas, utilizou-se o que plano focal, como determinado o limiar para identificação da cápsula, se eles usaram o raio ou o diâmetro, eles utilizado uma medição ou a média de vários, ou outros detalhes. Algumas publicações único Estado seu método como qual programa foi usado, por exemplo, "Adobe Photoshop CS3 foi usado para medir as células"11. Esta falta de padronização e relatando detalhes pode dificultar a reprodutibilidade se não impossível. Diferenças na visão humana, brilho do computador, configurações do microscópio, deslize a iluminação, e outros fatores podem variar não só entre indivíduos, mas entre as amostras, Considerando que cálculos baseados em proporções de valores de intensidade do pixel permanecerá constantes e aplicáveis entre as amostras. Esta técnica foi gerada no contexto de fornecer uma técnica padronizada, precisa, rápida e simples para medir tamanhos de cápsulas para um campo em que não havia nenhum antes.
Como mencionado anteriormente, o algoritmo CHT é bem estabelecida, e scripts para detectar automaticamente os círculos foram escritos antes. Esse método melhora em duas áreas onde outros scripts que ficam aquém. Em primeiro lugar, simplesmente detectar círculos não é suficiente, porque com células criptocócica devem ser detectados dois círculos distintos em relação à outra. Esse método especificamente detecta corpos celulares dentro de cápsulas, discrimina entre os dois e realiza cálculos apenas sobre os pares de corpo-cápsula relevantes. Em segundo lugar, mesmo quando seguir o mesmo protocolo, diferentes investigadores vai acabar com diferentes adquiridas imagens. Permitindo o controle do investigador sobre cada parâmetro de algoritmo, esta ferramenta pode ser ajustada para coincidir com uma ampla gama de métodos de aquisição. Não há nenhuma necessidade para um escopo padronizado, objetivo, filtro e assim por diante.
Esta técnica pode ser aplicada facilmente a qualquer situação em que o investigador precisa detectar círculos dentro de uma imagem que contrastam com o fundo. Ambos os círculos mais leves e mais escuros do seu plano de fundo pode ser detectado, contados e medidos usando esta técnica.

<table><tbody><tr><td>Tinta da Índia</td><td>Becton, Dickinson e Co.</td><td></td><td></td>261194</tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Superfrost Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-143</td><td>25x75x1</td></tr><tr><td>Fisherfinest Tampa de Vidro Premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-B</td><td>22x22-1</td></tr><tr><td>Esmalte Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear</td><td>Sally Hansen</td><td>N/A</td><td>109 invisível</td></tr><tr><td>SAB Media</td><td>Sigma</td><td>S3306</td><td></td></tr><tr><td>Cryptotoccus neoformans</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td>H99 cepa</td></tr><tr><td>Olympus AX70 Microscópio</td><td>Olympus</td><td>AX70TRF</td><td>Descontinuado ; Microscópio de Campo Brilhante</td></tr><tr><td>Qimaging Retiga 1300</td><td>Qimaging</td><td>N/A</td><td>Descontinuado ; Acessório de microscópio de câmera</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Versão mais recente recomendada</td></tr> Python <tr><td>Linguagem de programação</td><td>Python</td> N<td>/A</td><td>Versão 2 necessária; 2.7 recomendado</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Versão mais recente recomendada</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr></tbody></table>

automáticos de medição de criptocócica espécie polissacarídeo cápsula e corpo celular

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

O objetivo desta técnica é fornecer um processo consistente, preciso e gerenciável para grande número de medições da cápsula de polissacarídeo.
Primeiro, uma imagem de limiar é gerada com base nos valores de intensidade calculados exclusivamente para cada imagem. Em seguida, círculos são detectados com base no contraste entre o objeto e o plano de fundo usando o algoritmo de transformação de Hough de círculo (CHT) bem estabelecida. Finalmente, a célula detectado cápsulas e corpos são comparados de acordo com o tamanho do raio e as coordenadas do centro, e dados são exportados para o usuário em uma planilha gerenciável.
As vantagens desta técnica são simples, mas significativo. Primeiro, porque esses cálculos são executados por um algoritmo, ao invés de um ser humano tanto a precisão e a confiabilidade são aumentadas. Não há nenhuma diminuição na precisão ou confiabilidade independentemente de quantas amostras são analisadas. Em segundo lugar, esta abordagem estabelece um potencial o procedimento padrão para o campo de Cryptococcus em vez da situação atual onde cápsula medição varia de acordo com o laboratório. Em terceiro lugar, dado que a medição manual da cápsula é lentas e monótonas, automação permite medições rápidas em um grande número de células de levedura que por sua vez facilita a análise de dados de alta taxa de transferência e estatísticas cada vez mais poderosas.
As principais limitações desta técnica vem como as funções do algoritmo. Em primeiro lugar, o algoritmo só irá gerar círculos. Enquanto as células Cryptococcus e suas cápsulas assumem uma morfologia circular, seria difícil aplicar esta técnica para detecção de objeto não-circular. Em segundo lugar, devido a como os círculos são detectados o algoritmo CHT pode detectar enormes círculos pseudo baseados-se nas bordas exteriores de vários círculos em cluster. No entanto, qualquer deturpados corpos celulares, pego dentro do círculo de pseudo podem ser facilmente detectados e removidos os conjuntos de dados resultantes.
Esta técnica é destinada a medir as cápsulas circulares polissacarídeo de espécies de Cryptococcus baseado em microscopia de campo claro tinta nanquim; Embora poderia ser aplicada para outro contraste com base em medições objeto circular.

Imagens primeiro são obtidas pela microscopia de Nanquim slides usando um microscópio de campo claro, juntamente com uma câmera (Figura 1A). É importante que as células separadas e em densidade suficientemente baixa para não sobrecarregar o campo de visão, bem como como usar bastante mancha para criar contraste entre células e plano de fundo. Conforme o protocolo, o número exato de células para uma óptima imagem irá variar dependendo da amost...

Esta técnica descreve um processador de imagem de lote automatizado projetado para medir raios de cápsula e corpo de polissacarídeo. Embora inicialmente projetado para medições de Cryptococcus neoformans cápsula o processador de imagem automático também pode ser aplicado a outra detecção de contraste à base de objetos circulares.

Automáticos de medição de criptocócica espécie polissacarídeo cápsula e corpo celular

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

O objetivo geral dessa técnica é automatizar medições manuais tediosas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo criptocócico, como a relação entre o tamanho da cápsula ou do corpo celular e os diferentes aspectos da virulência. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a análise de enormes volumes de amostra sem fadiga.As implicações dessa técnica se estendem à terapia da criptococose, porque o tamanho da cápsula e do corpo celular são aspectos importantes do patógeno. Para preparar uma lâmina de tinta nanquim, comece pipetando 10 microlitros de amostra criptocócica em uma lâmina. Qualquer cepa yi circular com trabalho, mas para este experimento, H99 foi a única cepa usada.Pipete dois microlitros de tinta nanquim na amostra e misture-a empurrando fisicamente a ponta da pipeta para dentro da amostra e movendo-a em movimentos circulares até que a tinta nanquim pareça uniformemente distribuída. Coloque uma lamínula sobre a amostra mantendo pressionada a borda esquerda da lamínula contra a superfície da lâmina. Em seguida, abaixe suave e uniformemente o lado oposto da lamínula sobre a amostra.Deixe o slide secar ao ar por cinco minutos. Em seguida, apli

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio de opsono-aderência para examinar a interação entre bactérias opsonizadas e células imunes. Bactérias marcadas com fluorescência, tratadas com soro de teste contendo anticorpos anticápsula, são incubadas com macrófagos. Após a coloração dos macrófagos com fluorescência, as bactérias aderidas na superfície dos macrófagos são observadas ao microscópio para visualização.

Um ensaio de opsonidade para avaliar a opsonização de bactérias encapsuladas por anticorpos anticápsula

Aqui, demonstramos como citometria de imagem pode ser usada para quantificação de fungos patogénicos em associação com as células hospedeiras em cultura. Esta técnica pode ser usado como uma alternativa para CFU enumeração.

Uso de Citometria de imagem para quantificação de fungos patogênicos em associação com células do hospedeiro

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Apresentamos um método modular automatizado de alto rendimento para a identificação e caracterização de exopolissacarídeos microbianos em pequena escala. Este método combina uma pré-seleção rápida para analisar a quantidade total de polissacarídeos secretados com uma impressão digital detalhada de carboidratos para permitir a triagem rápida de cepas bacterianas recém-isoladas ou coleções inteiras de cepas.

Automated Modular High Throughput exopolissacï¿½ido Plataforma de Triagem Juntamente com Análise Carboidratos Fingerprint Highly Sensitive

A cápsula de polissacarídeo é o factor de virulência primária em Cryptococcus neoformans, e seu tamanho se correlaciona com a virulência da cepa. Medições de diâmetro da cápsula são usadas em testes fenotípicos e para avaliar a eficácia terapêutica. Aqui um método padrão de indução da cápsula é apresentado, e dois métodos de coloração e diâmetro de medição são comparados.

Size Matters: Medição do diâmetro da cápsula em Cryptococcus neoformans

Vamos mostrar o uso de gradientes de densidade descontínuo para separar populações bacterianas baseadas na produção da cápsula. Este método é usado para comparar a quantidade de cápsulas entre culturas, isolar os mutantes com um fenótipo específico da cápsula, ou para identificar os órgãos reguladores da cápsula. Aqui descrito é a otimização e a execução do ensaio.

Separando as bactérias por cápsula quantidade usando um gradiente descontínuo de densidade

Este papel detalha um protocolo para preparar uma cocultura de pilhas e de amebas criptocócica que é estudado usando imagens imóveis, fluorescentes e imagens de alta resolução do microscópio de elétron da transmissão. Ilustrados aqui é como os dados quantitativos podem complementar tais informações qualitativas.

Uso complementar de técnicas microscópicas e leitura de fluorescência no estudo de Cryptococcus-Amoeba interações

Este protocolo visa automatizar as medições de AFM em centenas de células microbianas. Primeiro, micróbios são imobilizados em microestruturas de selo PDMS e, em seguida, as medições de espectroscopia de força são realizadas automaticamente em centenas de células imobilizadas.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

A microscopia crio-elétron de partículas únicas exige um pacote de software adequado e um pipeline fácil de usar para aquisição automática de dados de alto rendimento. Aqui, apresentamos a aplicação de um pacote de software de aquisição de imagens totalmente automatizado, o Latitude-S, e um pipeline prático para coleta de dados de biomoléculas vitrificadas em condições de baixa dose.

Software de aquisição de dados totalmente automatizado para microscopia crio-elétron de partículas únicas

A levedura de fissão é usada aqui como um hospedeiro heterólogo para expressar proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, como proteínas de fusão translacional com GFP para visualizar sua polimerização. Além disso, os compostos que afetam a polimerização são identificados por imagens usando um microscópio de fluorescência.

Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano

Aprenda a automatizar medições de cápsula e corpo celular em Cryptococcus neoformans usando processamento de imagens. Esta técnica computacional melhora a eficiência e precisão na análise de grandes volumes amostrais.

Automáticos de medição de criptocócica espécie polissacarídeo cápsula e corpo celular

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