Automáticos de medição de criptocócica espécie polissacarídeo cápsula e corpo celular

O objetivo geral dessa técnica é automatizar medições manuais tediosas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo criptocócico, como a relação entre o tamanho da cápsula ou do corpo celular e os diferentes aspectos da virulência. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a análise de enormes volumes de amostra sem fadiga.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia da criptococose, porque o tamanho da cápsula e do corpo celular são aspectos importantes do patógeno. Para preparar uma lâmina de tinta nanquim, comece pipetando 10 microlitros de amostra criptocócica em uma lâmina. Qualquer cepa yi circular com trabalho, mas para este experimento, H99 foi a única cepa usada.

Pipete dois microlitros de tinta nanquim na amostra e misture-a empurrando fisicamente a ponta da pipeta para dentro da amostra e movendo-a em movimentos circulares até que a tinta nanquim pareça uniformemente distribuída. Coloque uma lamínula sobre a amostra mantendo pressionada a borda esquerda da lamínula contra a superfície da lâmina. Em seguida, abaixe suave e uniformemente o lado oposto da lamínula sobre a amostra.

Deixe o slide secar ao ar por cinco minutos. Em seguida, aplique uma leve camada de esmalte na borda da lamínula para formar uma vedação e preservar a mancha de tinta nanquim. Para obter imagens das amostras, coloque uma lâmina sob um microscópio de campo claro com o acessório da câmera e a conversão conhecida de pixel em mícron.

Ajuste os filtros, objetivas e contrastes e certifique-se de que o campo de visão seja denso, mas não superpovoado, com células criptocócicas com contraste claro entre a cápsula celular e o fundo, e devidamente focadas com o corpo celular visualizado como uma faixa escura. Depois de tirar as imagens, salve-as em um único diretório com títulos claros, pois o algoritmo de medição será executado em imagens em um único diretório e os dados de saída serão organizados de acordo com os nomes dos arquivos de imagem. Após a configuração do algoritmo de acordo com o protocolo de texto, execute o aplicativo clicando duas vezes em QCA.py.

Seguindo as etapas descritas no programa, insira o tipo de extensão dos arquivos de imagem, precedido por um ponto e separado por ponto e vírgula. Em seguida, clique no botão Enter. Escolha o diretório onde os arquivos de imagem estão localizados clicando no botão Selecionar diretório e selecione a pasta que contém as imagens.

Gere a lista de arquivos de imagem no diretório clicando no botão Gerar lista de imagens. As imagens serão listadas na caixa de texto à direita. Revise e certifique-se de que a lista seja precisa e completa.

Em seguida, selecione uma imagem aleatória da lista para usar como visualização clicando no botão Selecionar imagem aleatória. Em seguida, insira a objetiva do microscópio e as configurações de compartimentalização. Se as configurações padrão não corresponderem ao microscópio usado, selecione Conversão de pixel personalizada e insira a conversão de pixel para micrômetro para os arquivos de imagem.

Uma vez selecionado, clique no botão Calcular conversão e verifique se a conversão está correta de acordo com a caixa de texto à direita. Para inserir os parâmetros do algoritmo para detecção de círculo, insira o raio mínimo e máximo detectável para a detecção da cápsula externa, conforme as entradas de raio mínimo e máximo da cápsula. Em seguida, insira o raio mínimo e máximo detectável para detecção do corpo celular como as entradas de raio mínimo e máximo do corpo celular.

Agora, mova os controles deslizantes de sensibilidade da cápsula e do corpo celular para ajustar o limite de sensibilidade do algoritmo. Uma baixa sensibilidade será rigorosa e reduzirá a detecção de círculos falsos positivos, mas também poderá detectar menos círculos reais. Por outro lado, uma alta sensibilidade aumentará a taxa de detecção, mas também pode resultar em círculos falsos positivos.

Maximize o número de corpos e cápsulas detectados e inspecione visualmente se os círculos parecem se encaixar corretamente. O número de corpos dentro das cápsulas detectadas será exibido na caixa de texto à direita. Caso contrário, manipule os parâmetros do algoritmo até que os resultados sejam precisos.

Execute o algoritmo de detecção em todo o diretório de arquivos de imagem clicando no botão Iniciar análise. Cada imagem será analisada e o programa exibirá Concluído na caixa de texto à direita quando todas as imagens forem analisadas. Em seguida, clique no botão Combinar e limpar.

Isso combinará os corpos celulares detectados com as cápsulas detectadas em que residem e calculará o raio verdadeiro da cápsula subtraindo o corpo da cápsula. No diretório de imagens, localize os dados concluídos no CleanedOutput. csv.

Se apenas um dado foi selecionado, o arquivo será rotulado como CleanedBodies. csv ou CleanedCapsules.csv. Como visto aqui nesta imagem microscópica de uma lâmina de tinta nanquim, as células estão separadas e em densidade suficientemente baixa para não sobrecarregar o campo de visão.

Coloração suficiente também foi usada para criar contraste entre as células e o fundo. O algoritmo determina um limite exclusivo para cada imagem, tomando o valor médio de intensidade e adicionando o desvio padrão. As intensidades de pixel com uma intensidade superior ao limite são consideradas brancas e, com uma intensidade mais baixa, são consideradas pretas.

O corpo celular deve ser visualizado como um círculo preto robusto no fundo branco da cápsula. O melhor plano focal a ser usado é aquele em que o corpo celular aparece como uma faixa escura e concentrada. Este plano focal é aceitável como padrão, porque focaliza adequadamente a célula.

Este foi confirmado pela visualização da parede celular com UVITEX, um tipo de mancha que claramente uma parede celular nítida e focada com um sinal fraco no centro. Quando o protocolo é seguido com precisão e as imagens ideais são obtidas, o algoritmo é preciso e confiável. No entanto, se o protocolo for seguido incorretamente e imagens abaixo do ideal forem obtidas devido a coloração ruim, superlotação ou outros parâmetros mencionados anteriormente, o algoritmo perde precisão e não pode recapitular as medições humanas.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de 10 minutos se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter uma ideia de como adquirir imagens ideais com antecedência, para que você esteja preparado ao adquirir amostras reais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa criptocócica explorarem os tamanhos das cápsulas e do corpo celular em qualquer sistema de imagem em que os dois sejam claramente visualizados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir cápsulas criptocócicas e corpos celulares. Não se esqueça de que trabalhar com criptococo pode ser extremamente perigoso, e precauções como segurança básica do BSL2 devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.