Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

O objetivo geral deste procedimento é medir o efeito de moduladores de fenótipo, como silenciamento do gene do hospedeiro ou o impacto de pequenas moléculas no Mycobacterium tuberculosis, replicação intracelular. Isso é feito primeiro dispensando pequenas moléculas e placas de 384 poços ou células de transecção com irna e transfecção em complexo. O próximo passo é infectar células com proteína fluorescente verde que expressa Mycobacterium tuberculosis ou G-F-P-M-T-B, adicionar células à pequena molécula contendo poços e incubar a microplaca por cinco dias.

Para a abordagem de RNAi, adicione células ao complexo transfecto de RNAi contendo poços. Incubar a microplaca por três dias e, em seguida, infectar as células com G-F-P-M-T-B expressando mycobacterium tuberculosis. Depois de corar as células, a etapa final é ler as placas usando um microscópio confocal automatizado.

Em última análise, a microscopia de fluorescência automatizada seguida de análise baseada em imagem é usada para medir as mudanças no crescimento intracelular de G-F-P-M-T-V. A principal vantagem desta técnica de método existente, como a formação de colônias, é que ela poupa um longo período de incubação e permite mais rendimento. Demonstrando este procedimento estará Christophe Keval ou SONG e três bolsistas de pós-doutorado da minha equipe de pesquisa.

Os protocolos para triagem de biblioteca de RNA SI e triagem de biblioteca de compostos utilizam GFP de duas semanas de idade expressando culturas de MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV. Para preparar a suspensão bacteriana G-F-P-M-T-B, primeiro centrifugue a cultura a 4.000 Gs por cinco minutos, descarte os sobrenadantes Resus, suspenda a cultura em DPBS e centrifugue novamente dessa maneira. Lave a cultura três vezes com DPBS.

Após a terceira lavagem, descarte o supernat e ressuspenda o pellet bacteriano em 10 mililitros de 10% FBS contendo meio RPMI 1640. Deixe a suspensão por uma hora em temperatura ambiente para permitir que os agregados bacterianos sedimentem. Colete o supernat bacteriano e meça o OD em 600 nanômetros e fluorescência GFP.

Usando um leitor de microplacas para determinar a concentração bacteriana, o OD a 600 nanômetros deve estar entre 0,6 e 0,8. Calcular o título da suspensão utilizando uma linha de regressão de referência, apresentando o valor da UFR em função do valor da UFC gerado antes das experiências noutra cultura que tenha sido preparada nas mesmas condições. Uma concentração típica é de uma vez 10 elevado a oito bactérias por mililitro.

Comece este procedimento suspendendo a biblioteca de RNA SI seca que está armazenada em 96. Placas mãe de poço com um tampão X-S-I-R-N-A a uma concentração de dois micromolares. Transfira 10 microlitros da mistura para cada poço de uma placa filha de 384 poços Transfira 2,5 microlitros de RNA SI de cada poço da placa filha para uma placa de ensaio de 384 poços para a mesma placa de ensaio.

Adicione 2,5 microlitros de um IRNA de controle negativo e positivo aos seus respectivos poços. Se a placa auxiliar não for usada, sele-a imediatamente com uma vedação de alumínio destacável. A placa selada pode ser armazenada a 20 graus Celsius negativos por pelo menos seis meses e possivelmente até dois a três anos, dependendo da IRNA.

Recomendações do fabricante da biblioteca. Prepare os reagentes de transfecção diluindo-os em um X-D-P-B-S para produzir solução suficiente para fornecer 0,1 microlitros para cada um. Pré-incube a solução de transfecção diluída à temperatura ambiente por cinco minutos.

Adicione 7,5 microlitros da solução de transfecção diluída a cada poço da placa de ensaio de 384 poços e incube por 30 minutos em temperatura ambiente a cada poço da placa de ensaio a 40 microlitros de pneumócitos do tipo humano dois, A 5 4 9 células suspensas em meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%. Mantenha as células por um período de incubação de três dias a 37 graus Celsius em uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Essas células se dividem a cada 24 horas, portanto, cerca de 12.000 células estão em cada poço três dias após a transfecção.

Três dias depois si. A transfecção de RNA de 5 49 células prepara uma suspensão bacteriana MTBH 37 RV GFP. Como demonstrado anteriormente.

A suspensão deve conter 2,4 vezes 10 elevado a seis bactérias por mililitro, o que corresponde a uma multiplicidade de infecção de cinco. Remova o meio na placa de ensaio de 384 poços e adicione 25 microlitros da suspensão bacteriana por poço. Incube a placa de ensaio de poço 384 a 37 graus Celsius por cinco horas em uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono.

Depois de cinco horas. Remova o meio e lave suavemente as células três vezes com meio RPMI suplementado com 10% de FBS para matar as bactérias extracelulares restantes. Trate as células em cada poço com 50 microlitros.

Um meio R-P-M-I-F-B-S fresco contendo 50 microgramas por mililitro de amicacina. Incube a 37 graus Celsius por uma hora em uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Por fim, remova o meio contendo amicacina e adicione 50 microlitros de meio RPMI fresco suplementado com 10% de FBS por. Poço.

Incubar a placa de ensaio a 37 graus Celsius durante cinco dias numa atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono antes do rastreio por microscopia confocal. Para iniciar este procedimento, descongele uma placa-mãe de 384 poços contendo a biblioteca de compostos solubilizados em 100% de DMSO à temperatura ambiente, transfira 0,5 microlitros dos compostos da placa-mãe para uma placa-filha de 384 poços contendo 10 microlitros por poço de RPMI 1640. Meio suplementado com 10% FPS na próxima colheita de macrófagos humanos primários de seis dias de idade em quatro vezes 10 elevado a cinco células por mililitro em RPMI 1640.

Meio suplementado com 10%FPS e 50 nanogramas por mililitro. MCSF humano recombinante incuba as células primárias diluídas com basia em diferentes MOIs variando de um a cinco em suspensão com agitação leve a 90 RPM por duas horas a 37 graus Celsius. Lave as células infectadas por centrifugação a 350 GS por cinco minutos para remover as bactérias extracelulares.

Resus suspende os pellets em RPMI 1640. Meio suplementado com 10% FPS e centrífuga. Novamente, repita isso, lave duas vezes após a lavagem final.

Resus suspende as células infectadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 50 microgramas por mililitro. Amicacina incubar a suspensão com agitação suave por uma hora a 37 graus Celsius, centrífuga a 350 GS por cinco minutos. Remova o meio contendo amicacina e lave as células infectadas com RPMI 1640 completo.

Meio suplementado com 10% de FBS e 50 nanogramas por mililitro. MCSF humano recombinante. Repita esta lavagem uma vez.

Adicionar 40 microlitros por poço da suspensão de macrófagos infectados à mesma placa de ensaio de 384 poços preparada anteriormente, que já contém 10 microlitros das diluições do composto. A concentração final de DMSO em cada poço é agora de 1% Incube as placas de ensaio por cinco dias a 37 graus Celsius em uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono antes da triagem por microscopia confocal para biblioteca de RNA SI. Triagem antes da aquisição da imagem, adicione a cada poço da placa de ensaio 10 microlitros de 30 microgramas por mililitro DPI recém-preparados em PBS e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius.

Para triagem de compostos Antes da aquisição da imagem, core as células vivas com corante fluorescente vermelho distante permeável por 30 minutos a 37 graus Celsius. Carregue as placas de ensaio em um microscópio confocal automatizado. Defina os parâmetros de exposição para registrar a fluorescência DPI usando um laser de excitação a 405 nanômetros com um filtro de emissão a 450 nanômetros.

Registre a fluorescência GFP usando um laser de excitação a 488 nanômetros com um filtro de emissão a 520 nanômetros. Selecione os poços e os campos em cada poço a ser adquirido, que são então chamados de layouts e sublayouts. Os parâmetros geram o arquivo de experimentos usando os parâmetros definidos e executam a aquisição automática.

Nesse caso, quatro imagens diferentes do mesmo poço e campo são gravadas para transferir imagens para um servidor remoto. Posteriormente, as imagens são avaliadas usando o software de análise de imagem acapella 2.6 para triagem de RNA SI. Cada campo contém dois canais ou cores.

Verde para a bactéria e azul para a célula. Os núcleos detectam núcleos celulares do canal DAPI usando um algoritmo de detecção de núcleos e a área bacteriana do canal GFP usando um algoritmo de propriedades de intensidade de pixel. Ao mesclar os canais e contar o número de pixels compartilhados por bactérias e células, as bactérias intracelulares são quantificadas.

Os resultados finais expressos como uma média dos quatro campos são a área bacteriana total, o número total de células, a porcentagem de células infectadas e a área bacteriana por célula. Para triagem composta, cada campo contém dois canais ou cores, verde para a bactéria e vermelho distante para a célula. Os núcleos e o citoplasma detectam a área celular do canal vermelho distante e a área bacteriana do canal GFP usando um algoritmo de propriedades de intensidade de pixel.

Ao mesclar os canais e contar o número de pixels compartilhados por bactérias e núcleos, as bactérias intracelulares são quantificadas. Os resultados finais expressos como uma média dos quatro campos são a área bacteriana total, a área celular total, a área total de bactérias intracelulares e a razão entre a área bacteriana intracelular e a área total de células. Resultados representativos da triagem de RNA SI em todo o genoma de alto rendimento são apresentados aqui, silenciando a expressão de din one com SI RNA levou a uma diminuição da quantidade de micobactérias intracelulares em 5 49 células.

Como mostrado nessas imagens confocais representativas de 5 49 células transfectadas com IRNA não-alvo ou com RNA SI específico para din one e infectadas com GFP expressando MTB por cinco dias. GFP MT BH 37 RV foi visualizado em verde e as células em vermelho. O número de células e a carga intracelular de G-F-P-M-T-B-H 37 VD foram determinados usando software de análise baseado em imagem.

Este gráfico mostra a porcentagem de células infectadas a 5 49 em cinco réplicas de irna embaralhado representadas por círculos azuis e din um irna representado por círculos vermelhos. Após três dias de silenciamento e cinco dias de infecção, a porcentagem de células infectadas é reduzida pela metade em din um silenciado a 5 49 células em comparação com células transfectadas com IRNA de embaralhamento não-alvo. Uma normalização baseada em amostra de DIN direcionado ao RNA SI um em comparação com scramble foi aplicada para definir o Z-score.

Uma média de pontuação Z em torno de menos 15 foi obtida para SI, um DIN direcionado. Os três asteriscos representam um valor de P inferior a 0,0001. Esses resultados indicam que o DIN um pode ser usado como um controle positivo para o si, uma tela para descobrir outros novos fatores do hospedeiro envolvidos na colonização de MTB e pneumócitos que poderiam ter o mesmo fenótipo que o dins IRNA na triagem de compostos de alto teor.

A eficiência do composto no crescimento bacteriano intracelular foi avaliada estabelecendo uma curva de resposta à dose ou DRC e normalizando para os compostos positivos e negativos de referência. Neste exemplo, macrófagos primários humanos infectados por A GFP expressando a cepa MTBH 37 RV foram incubados com 1%DMSO como controle negativo ou com concentrações crescentes de dois compostos de referência, isid, INH e rifampicina. RIF. Os macrófagos são marcados com um corante de fluorescência vermelho e a cor verde indica que a análise de MTB das imagens de fluorescência confocal dos macrófagos humanos infectados revelou que os compostos ativos impactam a replicação intracelular do MTB nas células hospedeiras, levando a uma diminuição da carga micobacteriana, que corresponde à área do sinal GFP nas células.

A razão entre a área bacteriana intracelular e a área celular total foi calculada e, em seguida, plotada em função da concentração de compostos para gerar a DRC mostrada aqui estão as DRCs de isid e rifampicina em cada gráfico. A DRC do composto foi normalizada para 1% de DMSO, o controle negativo e 0,1 microgramas por mililitro é o controle positivo. Essas curvas permitem determinar tanto a concentração necessária para inibir 50% da colonização bacteriana quanto a concentração mínima necessária para inibir 99% da replicação bacteriana em um semestre.

Isso, esta técnica pode ser feita em 10 horas divididas da seguinte forma, duas horas para transfecção celular ou preparação de compostos, seis horas para infecção celular e dispensação em microplaca e duas horas para sustentação de uma aquisição de imagem. Isso durante um período de oito dias, não se esqueça de que trabalhar com mycobacterium tuberculosis pode ser extremamente como artistas e que precoces, como o uso de equipamentos de proteção individual, incluindo máscara, devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.