Résonance plasmonique de surface (SPR)
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Overview
Résonance de plasmons de surface (SPR) est le phénomène optique sous-jacente derrière exempte d’étiquette de biocapteurs pour évaluer l’affinité moléculaire, la cinétique, la spécificité et la concentration des biomolécules. À la SPR, interactions biomoléculaires se produisent sur un biocapteur fait d’une fine couche de métal sur un prisme. Les interactions en temps réel des biomolécules peuvent être surveillées en mesurant les changements de la lumière réfléchie par le dessous de la Metal
Cette vidéo décrit les concepts fondamentaux de la SPR et comment il est utilisé pour analyser et visualiser les interactions biomoléculaires. Elle est suivie d’une préparation de l’échantillon et le protocole expérimental pour enquêter sur les tarifs de liaison à l’aide de la SPR. Dans la section applications, l’imagerie de la SPR, SPR localisée et point quantique SPR amélioré sont explorées.
surface plasmon résonance, ou SPR, est le phénomène sous-jacent derrière certains biocapteurs exempte d’étiquette pour l’évaluation des interactions liant et adsorption de biomolécules. Essais de liaison nécessitant un étiquetage, comme ELISA, peuvent être un processus fastidieux et peuvent modifier les fonctionnalités de l’analyte. À la SPR, interactions biomoléculaires se produisent sur un capteur spécial, fait d’une fine couche de métal sur une des faces d’un prisme. En surveillant les changements de lumière réfléchie sur la face inférieure du métal, des instruments de SPR visualiser ces interactions en temps réel sans l’utilisation d’étiquettes. Cette vidéo mettra en place les principes de la SPR, une procédure générale pour l’imagerie de la SPR et certaines applications de biochimie.
an SPR capteur est habituellement fait d’une fine couche de métal noble au sommet de la face d’un prisme. Pour prendre une lecture de la sonde, la lumière est réfléchie sur l’interface prism-métal dans un photodétecteur. La lumière réfléchie aura une forte intensité sauf à un certain angle, lié aux propriétés électroniques de la surface métallique, appelée le " angle de résonance plasmonique de surface ".
Que les molécules se lient à la surface, changent les propriétés électroniques du métal, qui à son tour ajuste l’angle. Comme fixer de nouvelles protéines, formant des complexes, l’angle se déplacera plus loin. En mesurant les changements relatifs à l’angle de la SPR, interactions comme ceux-ci peuvent être surveillées en temps réel.
Une autre technique appelée localisée, ou " L " SPR, utilise des nanoparticules métalliques sous la surface du capteur. Les propriétés qui affectent l’angle de la SPR sont très localisées à chaque NANOPARTICULE, qui améliore la sensibilité et le signal de la résolution.
Lors d’enquêtes sur les interactions de liaison avec la norme SPR, le capteur est généralement monté sur une plate-forme qui devient le plancher d’une cellule de flux dans l’instrument. Les biomolécules d’intérêt sont transportés à travers la cellule de flux par solution tampon. La surface du capteur est souvent d’abord recouvert d’un substrat qui présente une forte affinité pour le métal. Ceci garantit qu’une quantité importante de ligand, qui à son tour se lie à l’analyte d’intérêt, va être immobilisée sur le capteur et réduit la probabilité que le ligand dissociera au cours de la procédure.
Une fois le ligand est immobilisé sur le capteur, l’analyte est transmise sur le capteur dans un tampon. En surveillant la variation dans l’angle de la SPR au fil du temps comme l’analyte se lie au ligand, peuvent être calculés le taux de liaison et d’autres informations cinétiques.
Les données de réflectance également utilisable pour l’imagerie de la SPR ou SPRi, de diriger la lumière réfléchie à un détecteur de CCD. Ceci produit une image de contraste élevé, haute résolution de la surface de l’ensemble du capteur. À l’aide de SPR et les techniques connexes, les questions peuvent être répondues sur affinité moléculaire, cinétique, spécificité et concentration.
Maintenant que vous comprenez ce qui est d’être mesuré dans une expérience de la SPR, laissez ' s coup d’oeil à une procédure d’enquête sur les tarifs de liaison.
avant de commencer les tampons de la procédure, l’exécution et l’échantillon doit être préparé. La mémoire tampon en cours d’exécution est utilisée pour déposer le ligand sur le capteur et la solution tampon est utilisée pour déposer de l’analyte. La puce du capteur est soigneusement nettoyée et chargée dans une gaine. Ensuite, l’appareil est placé dans l’appareil, où il devient le fond de la cellule de flux. Le logiciel de l’instrument est mis en place pour l’expérimentation et l’analyse ultérieure. Si nécessaire, la surface du capteur est amorcée avec un substrat pour capturer le ligand. Le ligand est coulé sur la surface du capteur dans la mémoire tampon en cours d’exécution, où il est capturé par le substrat sur la surface du capteur.
Puis, l’analyte dans la solution tampon est géré par la cellule de flux, où il se lie sélectivement au ligand immobilisé. Le changement de réflectance est tracé et comparé à des contrôles afin de déterminer les constantes de vitesse et autres données de cinétique de réaction de la réaction étudiée.
maintenant que vous comprenez comment une expérience SPR est effectuée, que ' s coup d’oeil à quelques autres applications de SPR en biochimie.
Ici, imagerie SPR a été utilisée pour évaluer des protéines avec un tableau d’onze récepteurs sur un capteur 3D graphiques de réflectivité par rapport au temps et concentration de récepteurs sont préparés à partir des données de réflectivité pour chaque protéine. Ces " profils " sont caractéristiques pour chaque protéine et donc pourrait ensuite être utilisé pour identification des protéines.
Dans cette expérience, les sécrétions des cellules ont été étudiées en utilisant un capteur LSPR sur mesure. Le capteur était également compatible avec les microscopes SPRi et fluorescence. Lors du dépôt de la cellule sur le capteur, l’interaction entre les sécrétions des cellules avec le tableau de nanoparticules pouvait être mesurés avec une résolution spatiale élevée.
Ici, l’utilisation de points quantiques semi-conducteurs nanométriques, comme un agent de renforcement de signal SPR mélangée avec l’analyte a été étudiée. Cela renforcé " nano-SPRi " méthode a été comparée aux déterminations de SPRi standard et la méthode ELISA. La méthode de nano-SPRi a considérablement amélioré la sensibilité et la limite de détection tout en étant moins fastidieux que la méthode ELISA.
vous ' ve juste regardé JoVE ' s-vidéo sur la résonance plasmonique de surface. Ce phénomène est utilisé pour le moniteur et l’image des interactions biomoléculaires sans l’utilisation d’étiquettes. Cette vidéo présente les principes de la SPR, un protocole typique pour réaliser une expérience de la SPR et quelques applications de SPR en biochimie.
Merci pour regarder !
Procedure
Disclosures
Transcript
Surface plasmon resonance, or SPR, is the underlying phenomenon behind certain label-free biosensors for evaluating binding and adsorption interactions of biomolecules. Binding assays that require labeling, such as ELISA, can be a time-consuming process, and may alter the functionality of the analyte. In SPR, biomolecular interactions occur on a special sensor made of a thin layer of metal on one face of a prism. By monitoring the changes in light reflected off of the underside of the metal, SPR instruments visualize these interactions in real-time without the use of labels. This video will introduce the principles of SPR, a general procedure for SPR imaging, and some applications of in biochemistry.
An SPR sensor is usually made of a thin layer of a noble metal atop the face of a prism. To take readings from the sensor, light is reflected off of the prism-metal interface into a photodetector. The reflected light will have a high intensity except at a certain angle, related to the electronic properties of the metal surface, known as the “surface plasmon resonance angle”.
As molecules bind to the surface, the electronic properties of the metal change, which in turn adjusts the angle. As new proteins attach, forming complexes, the angle will shift further. By measuring relative changes in the SPR angle, interactions like these can be monitored in real-time.
Another technique called localized, or “L”SPR, uses metal nanoparticles as the sensor surface. The properties that affect the SPR angle are highly localized to each nanoparticle, which improves sensitivity and signal resolution.
When investigating binding interactions with standard SPR, the sensor is generally mounted in a platform that becomes the floor of a flow cell in the instrument. The biomolecules of interest are carried through the flow cell by buffer solution. The sensor surface is often first coated with a substrate that has a high affinity for the metal. This ensures that a significant amount of ligand, which in turn binds to the analyte of interest, will be immobilized onto the sensor and reduces the likelihood that the ligand will dissociate during the procedure.
Once the ligand is immobilized on the sensor, the analyte is flowed over the sensor in buffer. By monitoring the change in the SPR angle over time as the analyte binds to the ligand, the binding rate and other kinetic information can be calculated.
The reflectance data can also be used for SPR imaging, or SPRi, by directing the reflected light to a CCD detector. This produces a high-contrast, high-resolution image of the entire sensor surface. Using SPR and the related techniques, questions can be answered about molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration.
Now that you understand what is being measured in an SPR experiment, let’s look at a procedure for investigating binding rates.
Before beginning the procedure, the running and sample buffers must be prepared. The running buffer is used to deposit the ligand onto the sensor, and the sample buffer is used to deposit the analyte. The sensor chip is carefully cleaned and loaded into a sheath. Then, the device is placed into the instrument, where it becomes the bottom of the flow cell. The instrument software is set up for the experiment and subsequent analysis. If necessary, the sensor surface is primed with a substrate to capture the ligand. The ligand is flowed over the sensor surface in the running buffer, where it is captured by the substrate on the sensor surface.
Then, the analyte in the sample buffer is run through the flow cell, where it selectively binds to the immobilized ligand. The change in reflectance is plotted and compared against controls to determine rate constants and other reaction kinetics data for the investigated reaction.
Now that you understand how an SPR experiment is performed, let’s look at a few other applications of SPR in biochemistry.
Here, SPR imaging was used to evaluate proteins with an array of eleven receptors on a sensor. 3D graphs of reflectivity versus time and receptor concentration were prepared from the reflectivity data for each protein. These “profiles” are characteristic to each protein, and thus could subsequently be used for protein identification.
In this experiment, cell secretions were studied using a custom-made LSPR sensor. The sensor was also compatible with SPRi and fluorescence microscopy. Upon depositing the cell on the sensor, the interaction of cell secretions with the nanoparticle array could be measured with high spatial resolution.
Here, the use of quantum dots, nanoscale semiconductors, as an SPR signal enhancement agent mixed with the analyte was investigated. This enhanced “nano-SPRi” method was compared to assays by standard SPRi and the ELISA method. The nano-SPRi method significantly improved the sensitivity and limit of detection while still being less time-consuming than the ELISA method.
You’ve just watched JoVE’s video on surface plasmon resonance. This phenomenon is used to monitor and image biomolecular interactions without the use of labels. This video introduced the principles of SPR, a typical protocol for performing an SPR experiment, and a few applications of SPR in biochemistry.
Thanks for watching!
