Ressonância de Plasmons de Superfície (SPR)
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Overview
A ressonância de plasmon superficial (SPR) é o fenômeno óptico subjacente por trás de biosensores livres de rótulos para avaliar a afinidade molecular, cinética, especificidade e concentração de biomoléculas. Em SPR, interações biomoleculares ocorrem em um biosensor feito de uma fina camada de metal em um prisma. As interações em tempo real das biomoléculas podem ser monitoradas medindo as mudanças de luz refletidas na parte inferior do metal.
Este vídeo descreve os conceitos básicos da RSE e como ele é usado para analisar e visualizar interações biomoleculares. Isso é seguido por uma preparação amostral e um protocolo experimental para investigar taxas vinculantes usando SPR. Na seção de aplicações, imagens SPR, SPR localizada e SPR aprimorada de ponto quântico são explorados.
A ressonância de plasmon superficial, ou SPR, é o fenômeno subjacente por trás de certos biosensores livres de rótulos para avaliar interações de vinculação e adsorção de biomoléculas. Ensaios de vinculação que requerem rotulagem, como o ELISA, podem ser um processo demorado, podendo alterar a funcionalidade do analito. Em SPR, interações biomoleculares ocorrem em um sensor especial feito de uma fina camada de metal em uma face de um prisma. Ao monitorar as mudanças de luz refletidas na parte inferior do metal, os instrumentos SPR visualizam essas interações em tempo real sem o uso de etiquetas. Este vídeo introduzirá os princípios da SPR, um procedimento geral para imagem SPR, e algumas aplicações de na bioquímica.
Um sensor SPR é geralmente feito de uma fina camada de um metal nobre em cima da face de um prisma. Para tirar leituras do sensor, a luz é refletida fora da interface prisma-metal em um fotodetetor. A luz refletida terá uma alta intensidade, exceto em um certo ângulo, relacionada às propriedades eletrônicas da superfície metálica, conhecida como “ângulo de ressonância plasmon superficial”.
À medida que as moléculas se ligam à superfície, as propriedades eletrônicas do metal mudam, o que por sua vez ajusta o ângulo. À medida que novas proteínas se anexam, formando complexos, o ângulo mudará ainda mais. Medindo mudanças relativas no ângulo SPR, interações como essas podem ser monitoradas em tempo real.
Outra técnica chamada localização, ou “L”SPR, usa nanopartículas metálicas como superfície do sensor. As propriedades que afetam o ângulo SPR são altamente localizadas a cada nanopartícula, o que melhora a sensibilidade e a resolução do sinal.
Ao investigar interações de ligação com o SPR padrão, o sensor é geralmente montado em uma plataforma que se torna o chão de uma célula de fluxo no instrumento. As biomoléculas de interesse são transportadas através da célula de fluxo por solução tampão. A superfície do sensor é frequentemente revestida pela primeira vez com um substrato que tem uma alta afinidade com o metal. Isso garante que uma quantidade significativa de ligante, que por sua vez se liga ao analito de interesse, será imobilizada no sensor e reduz a probabilidade de que o ligante se dissociará durante o procedimento.
Uma vez que o ligante é imobilizado no sensor, o analito é fluído sobre o sensor em buffer. Monitorando a alteração no ângulo SPR ao longo do tempo à medida que o analito se liga ao ligante, a taxa de vinculação e outras informações cinéticas podem ser calculadas.
Os dados de reflectância também podem ser usados para imagens spr, ou SPRi, direcionando a luz refletida para um detector de CCD. Isso produz uma imagem de alto contraste e alta resolução de toda a superfície do sensor. Utilizando SPR e as técnicas relacionadas, as perguntas podem ser respondidas sobre afinidade molecular, cinética, especificidade e concentração.
Agora que você entende o que está sendo medido em um experimento spr, vamos olhar para um procedimento para investigar taxas vinculantes.
Antes de iniciar o procedimento, os buffers de corrida e amostra devem ser preparados. O buffer de execução é usado para depositar o ligante no sensor, e o buffer de amostra é usado para depositar o analito. O chip do sensor é cuidadosamente limpo e carregado em uma baia. Em seguida, o dispositivo é colocado no instrumento, onde se torna a parte inferior da célula de fluxo. O software de instrumentos está configurado para o experimento e análise subsequente. Se necessário, a superfície do sensor é preparada com um substrato para capturar o ligante. O ligante é fluído sobre a superfície do sensor no buffer de corrida, onde é capturado pelo substrato na superfície do sensor.
Em seguida, o analito no tampão amostral é executado através da célula de fluxo, onde se liga seletivamente ao ligante imobilizado. A mudança na reflexão é plotada e comparada com os controles para determinar as constantes de taxa e outros dados de cinética de reação para a reação investigada.
Agora que você entende como um experimento SPR é realizado, vamos olhar para algumas outras aplicações de SPR em bioquímica.
Aqui, a imagem SPR foi utilizada para avaliar proteínas com uma matriz de onze receptores em um sensor. Gráficos 3D de reflexividade versus tempo e concentração receptora foram preparados a partir dos dados de reflexividade de cada proteína. Esses “perfis” são característicos de cada proteína e, portanto, poderiam ser posteriormente utilizados para identificação de proteínas.
Neste experimento, secreções celulares foram estudadas usando um sensor LSPR personalizado. O sensor também era compatível com SPRi e microscopia de fluorescência. Ao depositar a célula no sensor, a interação das secreções celulares com a matriz de nanopartículas poderia ser medida com alta resolução espacial.
Aqui, foi investigado o uso de pontos quânticos, semicondutores nanoescala, como agente de aprimoramento de sinal SPR misturado com o analito. Este método aprimorado “nano-SPRi” foi comparado aos ensaios do SPRi padrão e do método ELISA. O método nano-SPRi melhorou significativamente a sensibilidade e o limite de detecção, sendo ainda menos demorado do que o método ELISA.
Você acabou de ver o vídeo de JoVE sobre ressonância de plasmon superficial. Este fenômeno é usado para monitorar e imagem de interações biomoleculares sem o uso de rótulos. Este vídeo introduziu os princípios do SPR, um protocolo típico para a realização de um experimento spr, e algumas aplicações de SPR em bioquímica.
Obrigado por assistir!
Procedure
Disclosures
Transcript
Surface plasmon resonance, or SPR, is the underlying phenomenon behind certain label-free biosensors for evaluating binding and adsorption interactions of biomolecules. Binding assays that require labeling, such as ELISA, can be a time-consuming process, and may alter the functionality of the analyte. In SPR, biomolecular interactions occur on a special sensor made of a thin layer of metal on one face of a prism. By monitoring the changes in light reflected off of the underside of the metal, SPR instruments visualize these interactions in real-time without the use of labels. This video will introduce the principles of SPR, a general procedure for SPR imaging, and some applications of in biochemistry.
An SPR sensor is usually made of a thin layer of a noble metal atop the face of a prism. To take readings from the sensor, light is reflected off of the prism-metal interface into a photodetector. The reflected light will have a high intensity except at a certain angle, related to the electronic properties of the metal surface, known as the “surface plasmon resonance angle”.
As molecules bind to the surface, the electronic properties of the metal change, which in turn adjusts the angle. As new proteins attach, forming complexes, the angle will shift further. By measuring relative changes in the SPR angle, interactions like these can be monitored in real-time.
Another technique called localized, or “L”SPR, uses metal nanoparticles as the sensor surface. The properties that affect the SPR angle are highly localized to each nanoparticle, which improves sensitivity and signal resolution.
When investigating binding interactions with standard SPR, the sensor is generally mounted in a platform that becomes the floor of a flow cell in the instrument. The biomolecules of interest are carried through the flow cell by buffer solution. The sensor surface is often first coated with a substrate that has a high affinity for the metal. This ensures that a significant amount of ligand, which in turn binds to the analyte of interest, will be immobilized onto the sensor and reduces the likelihood that the ligand will dissociate during the procedure.
Once the ligand is immobilized on the sensor, the analyte is flowed over the sensor in buffer. By monitoring the change in the SPR angle over time as the analyte binds to the ligand, the binding rate and other kinetic information can be calculated.
The reflectance data can also be used for SPR imaging, or SPRi, by directing the reflected light to a CCD detector. This produces a high-contrast, high-resolution image of the entire sensor surface. Using SPR and the related techniques, questions can be answered about molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration.
Now that you understand what is being measured in an SPR experiment, let’s look at a procedure for investigating binding rates.
Before beginning the procedure, the running and sample buffers must be prepared. The running buffer is used to deposit the ligand onto the sensor, and the sample buffer is used to deposit the analyte. The sensor chip is carefully cleaned and loaded into a sheath. Then, the device is placed into the instrument, where it becomes the bottom of the flow cell. The instrument software is set up for the experiment and subsequent analysis. If necessary, the sensor surface is primed with a substrate to capture the ligand. The ligand is flowed over the sensor surface in the running buffer, where it is captured by the substrate on the sensor surface.
Then, the analyte in the sample buffer is run through the flow cell, where it selectively binds to the immobilized ligand. The change in reflectance is plotted and compared against controls to determine rate constants and other reaction kinetics data for the investigated reaction.
Now that you understand how an SPR experiment is performed, let’s look at a few other applications of SPR in biochemistry.
Here, SPR imaging was used to evaluate proteins with an array of eleven receptors on a sensor. 3D graphs of reflectivity versus time and receptor concentration were prepared from the reflectivity data for each protein. These “profiles” are characteristic to each protein, and thus could subsequently be used for protein identification.
In this experiment, cell secretions were studied using a custom-made LSPR sensor. The sensor was also compatible with SPRi and fluorescence microscopy. Upon depositing the cell on the sensor, the interaction of cell secretions with the nanoparticle array could be measured with high spatial resolution.
Here, the use of quantum dots, nanoscale semiconductors, as an SPR signal enhancement agent mixed with the analyte was investigated. This enhanced “nano-SPRi” method was compared to assays by standard SPRi and the ELISA method. The nano-SPRi method significantly improved the sensitivity and limit of detection while still being less time-consuming than the ELISA method.
You’ve just watched JoVE’s video on surface plasmon resonance. This phenomenon is used to monitor and image biomolecular interactions without the use of labels. This video introduced the principles of SPR, a typical protocol for performing an SPR experiment, and a few applications of SPR in biochemistry.
Thanks for watching!
