表面プラズモン共鳴 (SPR)
English
Share
Overview
表面プラズモン共鳴 (SPR) 分子の親和性、反応速度論、特異性、および生体分子の濃度を評価するためのバイオ センサーの無料のラベルの背後にある根本的な光学現象であります。SPR バイオ センサー プリズム上に金属の薄い層で生体分子相互作用が発生します。生体分子のリアルタイムの相互作用は、金属フロンディアの下面からの反射光の変化を測定することによって監視できます
このビデオは SPR と解析および生体分子の相互作用を可視化するための使用方法の基本的な概念を説明します。これは、サンプルの準備やスプレーを使用して結合率を調査するための実験プロトコルが続きますアプリケーション] セクションで、SPR イメージング、ローカライズされた SPR、量子ドットの増強 SPR を検討している
。表面プラズモン共鳴または SPR が生体分子の結合・吸着相互作用を評価するための特定のラベル無料バイオの背後にある根本的な現象。ラベル付け、ELISA などを必要とする結合の試金は時間のかかるプロセスをすることができ、試料の機能を変更することがあります。SPR、プリズムの片面に金属の薄い層で特殊なセンサーで生体分子相互作用が発生します。金属の底面から反射される光の変化を監視することによって、SPR 楽器のこれらの相互作用を可視化するラベルを使用せずリアルタイム。SPR、SPR イメージングのための一般的な手順と生物化学でのいくつかのアプリケーションの原則を紹介します
。の SPR センサーは通常プリズムの顔の上に貴金属の薄層から成っています。センサーからの測定値を取る、光は光検出器にプリズム金属インターフェイスから反映されます。反射光を除く高強度が金属表面の電子物性に関連する特定の角度として知られている、" 表面プラズモン共鳴角 ".
分子表面に bind が、金属の電子の特性変更、順番に角度を調整します。新しい蛋白質を添付、として複合体、角度シフトされますさらに。SPR 角度の相対的な変化を測定することによりこれらのような相互作用をリアルタイムで監視できます
。別技術呼ばれるローカライズされた、または " L " SPR センサーの表面として金属ナノ粒子を使用します。SPR 角度に影響を与えるプロパティ高い感度と信号の解像度を向上させる各のナノ粒子に局在している
。標準バインディングの相互作用を調査するとき SPR センサー一般に、計測器でのフロー ・ セルの床となるプラットフォームにマウントされます。興味の生体分子は、フローセルを緩衝液によって運ばれます。センサー表面は、金属のための高い親和性を持つ基質で被覆されて頻繁に最初。これにより、順番に興味の analyte 結合するリガンドのかなりの量をセンサーの上に固定される、プロシージャの間に配位子が分離してしまう可能性を低減します
。一度リガンド センサーの動員は、バッファー内のセンサー上の試料が流れていた。結合率と他のキネティック情報試料リガンドを結合として、時間の経過と共に SPR 角度の変更を監視することによってを計算できます
。反射率データも使えます、SPR イメージングや、スプリングによって CCD 検出器に反射した光を演出します。これは全体のセンサーの表面の高コントラスト、高解像度の画像を生成します。SPR と関連の技術を使用して、分子の親和性、反応速度論、特異性、濃度の質問は回答できます
。何をされるか分かっているので、SPR 実験で測定されるさせて ' 結合率を調査するための手順を見て
。プロシージャ、実行およびサンプル バッファーを開始を準備する必要があります前に。実行中のバッファーを使用して、センサーの上に配位子を預けるし、サンプル バッファーを使用して試料を入金します。センサー チップは丁寧に掃除して、鞘に読み込まれます。その後、デバイスは、フロー ・ セルの下部になる楽器に配置されます。計測器ソフトウェアの実験とその後の分析のセットアップします。必要に応じて、リガンドをキャプチャする基板を用いたセンサーの表面は準備万端します。センサー表面に基質によってキャプチャされます実行バッファー内センサーの表面上の配位子が流れていた
。、サンプル バッファーの検体は、それが選択的に固定化リガンド結合のフロー ・ セルを介して実行されます。反射率の変化をプロットし、速度定数および他調査の反応の反応速度データを決定するコントロールと比較します
。SPR 実験を行う方法を理解すると、今、' 生化学における SPR のいくつかの他のアプリケーションを見て
。ここ、SPR イメージングは、時間に対する反射率のセンサー 3 D グラフ 11 受容体の配列がタンパク質を評価する使用され、蛋白質ごとの反射率データから受容体濃度を調製します。これら " プロファイル " 各蛋白質に独特があり、したがって、タンパク質同定のためその後使用できる
。この実験では、細胞の分泌物を調べたカスタムメイド LSPR センサーを用いたします。センサーは、スプリング、蛍光顕微鏡との互換性も。センサーのセルを入金時に細胞分泌物ナノ粒子配列との相互作用の高空間分解能で測定が可能です
。ここでは、量子ドット、ナノ半導体の試料と混合 SPR 信号の強化剤としての使用を検討しました。この高度な " ナノ SPRi " メソッドは、標準のスプリングと ELISA 法による試金に比較しました。ナノ SPRi メソッドは、感度と検出 ELISA 法よりも時間を節約しながら限界を大幅に向上します
。あなた ' ve を見たゼウス ' s 表面プラズモン共鳴のビデオ。この現象を使用して、ラベル、使用せずモニターと画像の生体分子相互作用します。このビデオは、SPR、生化学の SPR 実験、および SPR のいくつかのアプリケーションを実行するための一般的なプロトコルの原則を導入します
。見てくれてありがとう!
Procedure
Disclosures
Transcript
Surface plasmon resonance, or SPR, is the underlying phenomenon behind certain label-free biosensors for evaluating binding and adsorption interactions of biomolecules. Binding assays that require labeling, such as ELISA, can be a time-consuming process, and may alter the functionality of the analyte. In SPR, biomolecular interactions occur on a special sensor made of a thin layer of metal on one face of a prism. By monitoring the changes in light reflected off of the underside of the metal, SPR instruments visualize these interactions in real-time without the use of labels. This video will introduce the principles of SPR, a general procedure for SPR imaging, and some applications of in biochemistry.
An SPR sensor is usually made of a thin layer of a noble metal atop the face of a prism. To take readings from the sensor, light is reflected off of the prism-metal interface into a photodetector. The reflected light will have a high intensity except at a certain angle, related to the electronic properties of the metal surface, known as the “surface plasmon resonance angle”.
As molecules bind to the surface, the electronic properties of the metal change, which in turn adjusts the angle. As new proteins attach, forming complexes, the angle will shift further. By measuring relative changes in the SPR angle, interactions like these can be monitored in real-time.
Another technique called localized, or “L”SPR, uses metal nanoparticles as the sensor surface. The properties that affect the SPR angle are highly localized to each nanoparticle, which improves sensitivity and signal resolution.
When investigating binding interactions with standard SPR, the sensor is generally mounted in a platform that becomes the floor of a flow cell in the instrument. The biomolecules of interest are carried through the flow cell by buffer solution. The sensor surface is often first coated with a substrate that has a high affinity for the metal. This ensures that a significant amount of ligand, which in turn binds to the analyte of interest, will be immobilized onto the sensor and reduces the likelihood that the ligand will dissociate during the procedure.
Once the ligand is immobilized on the sensor, the analyte is flowed over the sensor in buffer. By monitoring the change in the SPR angle over time as the analyte binds to the ligand, the binding rate and other kinetic information can be calculated.
The reflectance data can also be used for SPR imaging, or SPRi, by directing the reflected light to a CCD detector. This produces a high-contrast, high-resolution image of the entire sensor surface. Using SPR and the related techniques, questions can be answered about molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration.
Now that you understand what is being measured in an SPR experiment, let’s look at a procedure for investigating binding rates.
Before beginning the procedure, the running and sample buffers must be prepared. The running buffer is used to deposit the ligand onto the sensor, and the sample buffer is used to deposit the analyte. The sensor chip is carefully cleaned and loaded into a sheath. Then, the device is placed into the instrument, where it becomes the bottom of the flow cell. The instrument software is set up for the experiment and subsequent analysis. If necessary, the sensor surface is primed with a substrate to capture the ligand. The ligand is flowed over the sensor surface in the running buffer, where it is captured by the substrate on the sensor surface.
Then, the analyte in the sample buffer is run through the flow cell, where it selectively binds to the immobilized ligand. The change in reflectance is plotted and compared against controls to determine rate constants and other reaction kinetics data for the investigated reaction.
Now that you understand how an SPR experiment is performed, let’s look at a few other applications of SPR in biochemistry.
Here, SPR imaging was used to evaluate proteins with an array of eleven receptors on a sensor. 3D graphs of reflectivity versus time and receptor concentration were prepared from the reflectivity data for each protein. These “profiles” are characteristic to each protein, and thus could subsequently be used for protein identification.
In this experiment, cell secretions were studied using a custom-made LSPR sensor. The sensor was also compatible with SPRi and fluorescence microscopy. Upon depositing the cell on the sensor, the interaction of cell secretions with the nanoparticle array could be measured with high spatial resolution.
Here, the use of quantum dots, nanoscale semiconductors, as an SPR signal enhancement agent mixed with the analyte was investigated. This enhanced “nano-SPRi” method was compared to assays by standard SPRi and the ELISA method. The nano-SPRi method significantly improved the sensitivity and limit of detection while still being less time-consuming than the ELISA method.
You’ve just watched JoVE’s video on surface plasmon resonance. This phenomenon is used to monitor and image biomolecular interactions without the use of labels. This video introduced the principles of SPR, a typical protocol for performing an SPR experiment, and a few applications of SPR in biochemistry.
Thanks for watching!
